DAZ基因家族DAZL-BOULE與犏牛雄性不育關(guān)系的研究.pdf

1、牦牛是牛屬動(dòng)物中唯一能適應(yīng)高寒氣候環(huán)境而延續(xù)至今的牛種，屬珍稀畜種資源和生產(chǎn)性能低的原始牛種，也是世界屋脊的“景觀牛種”.為了提高其生產(chǎn)性能，人們一直利用普通牛同牦牛進(jìn)行種間雜交，獲得具有明顯雜種優(yōu)勢(shì)的一代雜種犏牛。但由于犏牛雄性不育，種間雜交不能達(dá)到改良牦牛遺傳本質(zhì)和充分利用牦牛遺傳資源的目的，雜種優(yōu)勢(shì)的利用和新型牛種的培育均受到了極大的限制，成為牦牛雜交改良的“攔路虎”。近幾十年來(lái)，為探討犏牛雄性不育的問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)犏牛雄性

2、不育這一復(fù)雜的生物現(xiàn)象坐了很多有意義的研究和探討，但至今尚未找到犏牛雄性不育的主導(dǎo)原因。DAZ基因家族包括DAZ(Deleted in Azoospermia)、DAZL(DAZ-like)和BOULE基因，是精子生成的重要調(diào)控因子。DAZL起源于BOULE基因，位于人類2號(hào)染色體，BOULE位于人類的3號(hào)染色體上，是DAZ基因家族的祖先基因。
　　 為了探討犏牛雄性不育問(wèn)題，本研究以成年健康雄性黃牛、牦牛和犏牛為研究對(duì)象，運(yùn)用

3、組織切片、RT-PCR克隆測(cè)序、Real-time PCR技術(shù)、原位雜交技術(shù)以及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)DAZL和BOULE基因的組織表達(dá)、在睪丸組織中的表達(dá)差異水平分析，和BOULE基因在黃牛精子發(fā)生中的組織定位，為研究犏牛雄性不育與DAZ基因家族的關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。
　　 1.牦牛、犏牛DAZL基因的克隆、序列分析及表達(dá)的研究
　　 本試驗(yàn)根據(jù)黃牛DAZL基因序列EF501823設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出牦牛和犏牛全長(zhǎng)分別為

4、1772bp、1778bp的序列，兩段序列包含完整的ORF編碼區(qū)，全長(zhǎng)為885bp，編碼295個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃牛編碼區(qū)序列與牦牛和犏牛分別為同源性分別為99.43％、98.31％，與其他動(dòng)物也具有較高的同源性。含有DAZ家族所具有的典型的RRM結(jié)構(gòu)域、DAZ重復(fù)基序，同時(shí)在N端還具有高度保守的PABP作用位點(diǎn)和Pumilio-2作用位點(diǎn)，說(shuō)明脊椎動(dòng)物的DAZL基因在進(jìn)化上是高度保守的。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，聚類結(jié)果與經(jīng)典分類學(xué)

5、結(jié)果基本一致，實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示，DAZL在三種牛睪丸組織中的表達(dá)量中，黃牛與牦牛差異顯著(P＜0.05)，黃牛與犏牛，犏牛與牦牛差異不顯著(P＞0.05)。推測(cè)DAZL基因與犏牛雄性不育無(wú)關(guān)。
　　 2.牦牛、犏牛BOULE基因的克隆、序列分析及表達(dá)的研究
　　 本試驗(yàn)根據(jù)黃牛BOULE基因序列(NM_001102115)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出牦牛和犏牛的全長(zhǎng)分別為1647bp、1650bp，該序列包含完整的編碼區(qū)，二者也

6、都含有885bp的相同的完整開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼一個(gè)295個(gè)氨基酸蛋白，進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牦牛、犏牛和黃牛BOULE基因編碼區(qū)核苷酸序列的同源性為99.85％，氨基酸序列的同源性為98.31％，在編碼區(qū)內(nèi)，三個(gè)物種共發(fā)現(xiàn)了4處堿基差異(0.45/100bp)，與其他動(dòng)物也具有較高的同源性，也含有DAZ基因家族所具有的典型的RRM結(jié)構(gòu)域、DAZ重復(fù)基序。系統(tǒng)發(fā)育分析與經(jīng)典分類結(jié)果也基本一致。實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示，BOULE基

7、因在三種牛睪丸組織中的表達(dá)量中，黃牛與牦牛差異不顯著(P＞0.05)，黃牛、牦牛，與犏牛差異顯著(P＜0.05)。推測(cè)BOULE基因與犏牛雄性不育有一定的關(guān)系。
　　 3.黃牛、牦牛、犏牛睪丸組織學(xué)觀察和BOULE m RNA在睪丸組織的表達(dá)研究
　　 制作黃牛、牦牛和犏牛睪丸組織的的石蠟切片并HE染色發(fā)現(xiàn)，黃牛睪丸組織生精小管發(fā)育正常，可見(jiàn)各級(jí)生精細(xì)胞，內(nèi)有不同時(shí)期大量的生精細(xì)胞，間質(zhì)組織和生精小管無(wú)間隙小或間隙小，而

8、牦牛睪丸組織生精小管也發(fā)育正常，可見(jiàn)各級(jí)生精細(xì)胞，犏牛睪丸組織生精小管官腔大小及形態(tài)不一致，管壁皺縮，生精小管上皮多由1～2層精原細(xì)胞構(gòu)成，有些精原細(xì)胞已經(jīng)死亡，初級(jí)精母細(xì)胞很少，無(wú)次級(jí)精母細(xì)胞犏牛生精小管由1～2層精原細(xì)胞構(gòu)成，精母細(xì)胞少，間質(zhì)組織與基底膜間隙寬，由組織液填充。原位雜交結(jié)果顯示，BOULE基因主要分布在初級(jí)精母細(xì)胞和次級(jí)精母細(xì)胞中，在其余各級(jí)細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)其表達(dá)，推測(cè)犏牛精子發(fā)生失敗，生精細(xì)胞凋亡等表象可能與BOULE基