棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的圖位克隆及PPR基因家族的分析.pdf

1、植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility, CMS)是一種不能產(chǎn)生有活力花粉的遺傳現(xiàn)象，屬母性遺傳，在植物雜種優(yōu)勢(shì)利用中具有重要價(jià)值.利用胞質(zhì)雄性不育系及恢復(fù)系和保持系的三系配套制種方式具有省工、方便、種子純度高、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，將成為雜種棉商業(yè)化制種最有效的途徑之一。棉花不僅是世界上最重要的天然纖維和重要的油料作物，而且也是一種重要的生物能源。棉花雜種優(yōu)勢(shì)十分明顯，可有效提高產(chǎn)量、纖維品質(zhì)與抗病、抗逆性

2、。棉花由于“三系”中的恢復(fù)系存在恢復(fù)力不強(qiáng)的缺陷使得棉花CMS的應(yīng)用受到極大的限制，“三系法”制種仍未實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。因此，克隆棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育育性恢復(fù)基因?qū)τ谘芯考?xì)胞質(zhì)雄性不育機(jī)理，培育優(yōu)良恢復(fù)系，更好的利用雜種優(yōu)勢(shì)具有重要的理論和實(shí)踐意義。
　　 目前已克隆的恢復(fù)基因中，除了玉米R(shí)f2編碼乙醛脫氫酶外，矮牽牛Rf、蘿卜Rf0及水稻的Rf1a和Rf1b都編碼的是由PPR基序串聯(lián)組成的PPR蛋白PPR基因家族是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)家

3、族，同時(shí)也是植物中最大的家族之一。它編碼一種以35個(gè)簡(jiǎn)并氨基酸為重復(fù)單位串連排列組成的蛋白質(zhì)，這些重復(fù)單元能形成一個(gè)超螺旋從而特異的與單鏈RNA結(jié)合。PPR蛋白在細(xì)胞器形成和植物發(fā)育的許多方面起著重要的調(diào)控作用。目前，在許多真核生物中都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了PPR基因，但棉花上還沒有關(guān)于PPR基因的報(bào)道。
　　 本研究選用本室根據(jù)GenBank棉花EST數(shù)據(jù)庫中的序列開發(fā)設(shè)計(jì)的2803對(duì)EST-SSR引物采用基因型代表群分析法對(duì)親本不育系1

4、04-7A和恢復(fù)系0-613-2R及22株小群體進(jìn)行篩選，將選中的6對(duì)引物對(duì)613株BC1群體進(jìn)行擴(kuò)增，共篩選到6個(gè)與Rf1基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。通過整合本室先前構(gòu)建的Rf1遺傳圖譜上的原有標(biāo)記，利用Joinmap3.0作圖軟件對(duì)恢復(fù)基因進(jìn)行精細(xì)定位，整合后的圖譜含有18個(gè)標(biāo)記（2個(gè)RAPD、3個(gè)STS標(biāo)記和13個(gè)SSR標(biāo)記），總遺傳距離為0.65cM.本研究所獲得的6個(gè)與Rf1緊密連鎖的EST-SSR標(biāo)記（NAU2650、NAU29

5、24、NAU3205、NAU3652、NAU3938和NAU4040）表現(xiàn)為共分離，均與Rf1基因相距0.327cM，其中NAU3205為顯性標(biāo)記，其它5個(gè)都是共顯性標(biāo)記。
　　 利用6個(gè)與Rf1緊密連鎖的EST-SSR標(biāo)記對(duì)本室構(gòu)建的0-613-2R恢復(fù)系BAC文庫進(jìn)行PCR篩選。先對(duì)二級(jí)混合克隆文庫進(jìn)行PCR篩選，篩選到陽性混合克隆后，再對(duì)一級(jí)混合克隆庫進(jìn)行篩選，最終得到陽性單克隆。6個(gè)EST-SSR標(biāo)記共篩選到7個(gè)陽性BA

6、C單克隆，其中NAU4040未篩選到陽性克隆，NAU3938篩選到3個(gè)陽性克隆，其它標(biāo)記各篩選到1個(gè)陽性克隆，NotI酶切檢測(cè)其插入片段大小范圍為105-130kb。將本室已獲得的與Rf1相關(guān)的克隆整合后在Rf1遺傳圖譜上的18對(duì)引物共獲得56個(gè)陽性BAC克隆.選取Rf1圖譜上兩側(cè)最近的13個(gè)標(biāo)記所篩選到的31個(gè)陽性BAC進(jìn)行HindⅢ酶切指紋分析，利用Image3.10b和FPCV7.2軟件對(duì)HindⅢ酶切圖譜進(jìn)行分析后構(gòu)建Rf1區(qū)域

7、的精細(xì)物理圖譜。
　　 利用蘿卜、矮牽牛和水稻恢復(fù)基因編碼的蛋白序列分別作為查詢探針對(duì)GenBank中棉花ESTs數(shù)據(jù)庫進(jìn)行tblastn掃描，對(duì)獲得的所有ESTs利用CAP3軟件組裝并通過blastx預(yù)測(cè)每個(gè)contig的功能，獲得三個(gè)與蘿卜、矮牽牛和水稻恢復(fù)基因同源性較高的contigs。根據(jù)這三個(gè)contigs的序列設(shè)計(jì)特異引物對(duì)物理圖譜上的所有BAC進(jìn)行篩選，其中根據(jù)contig2設(shè)計(jì)的引物篩選到一個(gè)克隆Y43。綜合物理

8、圖譜與同源序列分析的結(jié)果，將棉花Rf1基因定位在BACY43上并對(duì)該BAC全長(zhǎng)測(cè)序。對(duì)獲得的BAC序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，共獲得24個(gè)ORF，其中4個(gè)ORF(ORF2、ORF3、ORF7和ORF18)編碼PPR蛋白并含有線粒體定位信號(hào)。通過4個(gè)ORF的序列比對(duì)及對(duì)恢復(fù)系和不育系的測(cè)序比較，推斷ORF3為Rf1基因候選ORF。
　　 為了了解陸地棉中PPR基因的分布和數(shù)量，本研究從147個(gè)陸地棉BAC中找到6個(gè)編碼PPR蛋白的ORF，同

9、時(shí)利用其它植物中已克隆的18個(gè)PPR基因編碼的蛋白作為tblastn比對(duì)的查詢探針，對(duì)GenBank中陸地棉EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行掃描，通過CAP3組裝拼接鑒定出309個(gè)PPR unigene。為進(jìn)一步研究陸地棉中PPR基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)和表達(dá)特點(diǎn)，以陸地棉0-613-2R為材料通過RT-PCR的方法克隆了5個(gè)PPR基因的全長(zhǎng)cDNA序列，分別將它們命名為GhPPR1-GhPPR5，對(duì)其基因組結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)它們都不含有內(nèi)含子，ORF長(zhǎng)度從867

10、-1779 bp.結(jié)構(gòu)域分析顯示這5個(gè)PPR基因編碼的氨基酸分別包含5-10個(gè)PPR重復(fù)單元，其中GhPPR1和GhPPR2屬于PLS亞家族，GhPPR3-GhPPR5屬于P亞家族，同時(shí)這5個(gè)基因與18個(gè)其它植物中的PPR基因的進(jìn)化分析也顯示同一亞家族中的成員聚集在一起，本研究還利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)這5個(gè)PPR基因在陸地棉不同組織和器官中的表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示5個(gè)基因在根、莖、葉、花粉以及纖維中都表達(dá)，但在不同時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量略

11、有不同。
　　 育性基因的分離克隆一直是人們關(guān)心的課題，它對(duì)于認(rèn)識(shí)不育性機(jī)理，揭示生命現(xiàn)象以及更有效地利用雜種優(yōu)勢(shì)都有著十分重要的意義。本研究利用圖位克隆和同源序列克隆兩種方法相結(jié)合的策略，在構(gòu)建Rf1精細(xì)遺傳圖譜和物理圖譜的基礎(chǔ)上，根據(jù)恢復(fù)基因同源序列設(shè)計(jì)引物對(duì)物理圖譜上的BAC克隆進(jìn)行掃描，鑒定出包含Rf1基因的BAC克隆并對(duì)其全長(zhǎng)測(cè)序，通過基因預(yù)測(cè)和特征分析及親本序列差異分析獲得了Rf1的候選ORF。棉花CMS育性恢復(fù)基因