甘藍(lán)型油菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的圖位克隆和功能研究.pdf

1、波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育(pol CMS)是甘藍(lán)型油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用的主要途徑之一，同時(shí)也是研究核質(zhì)互作的良好載體。本研究通過圖位克隆的方法分離了波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育的育性恢復(fù)基因Rfp，并利用細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)研究，闡述了Pol CMS的敗育機(jī)理及Rfp基因在甘藍(lán)型油菜中的恢復(fù)功能。主要研究結(jié)果如下:
　　1.利用不育系6330A和恢復(fù)系Bing409構(gòu)建的回交群體通過圖位克隆的方法將波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因（R

2、fp）定位到甘藍(lán)型油菜A9染色體上一段長(zhǎng)約32kb的區(qū)間。對(duì)定位區(qū)間中的orf進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)為PPR家族成員，將之作為候選基因構(gòu)建載體。遺傳轉(zhuǎn)化證明該orf確實(shí)是波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因（Rfp）。
　　2.對(duì)該基因的全長(zhǎng)(包括啟動(dòng)子區(qū)，CDS和3'UTR)在不育系1141A和恢復(fù)系Bing409中進(jìn)行比較測(cè)序，比較測(cè)序結(jié)果表明Rfp與rfp啟動(dòng)子區(qū)和3'UTR區(qū)分別個(gè)有一個(gè)SNP，而在CDS上存在45個(gè)SNP，導(dǎo)致

3、30個(gè)氨基酸的改變，其中12個(gè)氨基酸的極性發(fā)生變化。亞細(xì)胞定位的結(jié)果顯示Rfp和rfp均定位于線粒體。這表明恢復(fù)基因與其等位基因功能的差異主要是由于CDS區(qū)的變異導(dǎo)致，但這些變異并未引起蛋白定位的改變?；谏鲜龅臏y(cè)序結(jié)果，開發(fā)了針對(duì)Rfp的功能標(biāo)記，可以高效地用于波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)材料的篩選和恢復(fù)系的回交選育。
　　3.半薄切片結(jié)果表明不育單株花藥在發(fā)育至第5期不能形成四個(gè)正常的角隅，向后發(fā)育也不能形成藥室或者形成1-2個(gè)形

4、態(tài)異常的藥室，而形成的藥室中小孢子的發(fā)育異常，最終不能形成花粉或者產(chǎn)生干癟的花粉。透射電鏡結(jié)果表明不育單株在花藥發(fā)育的第3期線粒體開始出現(xiàn)異常和崩解，可能引發(fā)孢原細(xì)胞的PCD，最終導(dǎo)致L2層細(xì)胞不能分化出正常的藥室內(nèi)壁，中層，絨氈層以及小孢子母細(xì)胞。
　　4.對(duì)Rfp基因進(jìn)行RT-PCR和qPCR分析，結(jié)果表明Rfp油菜的根、莖、葉、花和幼蕾各個(gè)組織中廣泛表達(dá)，幼蕾中表達(dá)量最高，GUS分析結(jié)果與之類似，說明恢復(fù)基因可能主要在花藥發(fā)

5、育早期起重要功能。在花藥中GUS染色結(jié)果表明Rfp表達(dá)的主要部位在L2層細(xì)胞特化出的藥室內(nèi)壁，中層，絨氈層以及小孢子母細(xì)胞（小孢子）中，這與不育表型相對(duì)應(yīng)。
　　5.為了探究Rfp可能的功能，以pol胞質(zhì)（不育系）和nap胞質(zhì)（保持系）線粒體組差異的orf作為探針進(jìn)行Northern blot的檢測(cè)。其中以orf224作為探針檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)在與不育系相比遺傳轉(zhuǎn)化復(fù)育系和恢復(fù)系中orf224-atp6轉(zhuǎn)錄本發(fā)生明顯減少，而保持系中基本檢

6、測(cè)不到信號(hào)。這表明Rfp可能通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的方式參與orf224轉(zhuǎn)錄本的加工從而恢復(fù)育性。
　　6.對(duì)Rfp進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其具有15個(gè)PPR結(jié)構(gòu)域，可能與RNA識(shí)別相關(guān)，但它本身不具有RNA剪切或者其他加工的結(jié)構(gòu)域，據(jù)此推測(cè)可能還存在其他未知蛋白參與該過程。通過酵母雙雜，在甘藍(lán)型油菜花蕾cDNA文庫(kù)中共篩選到了4個(gè)可能與Rfp互作的基因，通過BiFC的檢測(cè)證實(shí)這些互作在甘藍(lán)型油菜的線粒體中真實(shí)存在。對(duì)這些互作的基因進(jìn)行了干涉，它們的