大白菜波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育(pol CMS)及育性恢復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)研究.pdf

1、高等植物中廣泛存在的細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)現(xiàn)象是雜交育種最為有效的途徑之一，線粒體基因組的重組是引起這種變異的主要原因。雖然在十字花科作物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)數(shù)十種與CMS有關(guān)的ORF，但僅有數(shù)例能證明它們是引起CMS的直接原因。pol CMS被認(rèn)為是國(guó)際上“第一個(gè)有實(shí)用價(jià)值的油菜雄性不育類(lèi)型”，但對(duì)其不育及育性恢復(fù)的機(jī)理研究與其它作物（如水稻）相比較少。
　　本文對(duì)與大白菜pol CMS育性相關(guān)的基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量表達(dá)檢測(cè)及異位過(guò)表達(dá)分

2、析，以研究其可能的功能及在雄性器官發(fā)育中的作用。
　　我們分別構(gòu)建了orf224全長(zhǎng)和3'端未知片段的誘導(dǎo)性原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后發(fā)現(xiàn)orf2243'端編碼的重組蛋白對(duì)受體菌的生長(zhǎng)有明顯的抑制，而全長(zhǎng)orf224卻沒(méi)有這種效應(yīng)。這初步說(shuō)明orf224可能編碼一個(gè)毒性蛋白，通過(guò)其3'編碼多肽對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。為了證明orf224對(duì)植物雄性器官發(fā)育的影響，我們分別構(gòu)建了35S和花藥特異性(AP3)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的orf

3、224，轉(zhuǎn)化擬南芥獲得大量陽(yáng)性植株，目前正在分析陽(yáng)性苗育性的變化。
　　orf224及其5'、3'編碼多肽的亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，全長(zhǎng)及5'端均定位于線粒體和核內(nèi)，而3'蛋白在線粒體的定位減弱，不在核中定位，主要分布于細(xì)胞質(zhì)。ORF224有兩個(gè)跨膜區(qū)，僅第一個(gè)就可使其產(chǎn)物蛋白定位于線粒體，我們的實(shí)驗(yàn)證明僅保留了第二個(gè)跨膜區(qū)的C端就不能使其更有效的上線粒體膜。PPR蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)、線粒體及其它有待鑒定的細(xì)胞器，在核中也有較弱的定

4、位信號(hào)，這基本與預(yù)測(cè)一致。
　　分別對(duì)大白菜pol CMS不育系、保持系、恢復(fù)系及雜種F1代中與雄性不育相關(guān)的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析，結(jié)果表明，在不育系和雜種F1代不同花藥發(fā)育時(shí)期orf224-atp6可以共轉(zhuǎn)錄，但不育系保留大量較為完整的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，且隨著發(fā)育的進(jìn)行，到成熟期還保留大約40％左右。而在雜種F1中，保留完整的orf224-atp6共轉(zhuǎn)錄區(qū)的量只有不育系的1/4，說(shuō)明orf224-atp6的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物發(fā)生了大量的降解。

5、r>　　對(duì)不育系、保持系、恢復(fù)系的育性恢復(fù)相關(guān)PPR基因進(jìn)行了測(cè)序和同源性比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)恢復(fù)系有9個(gè)特異的SNP，影響氨基酸的編碼。同時(shí)，在未開(kāi)花期到開(kāi)花期的表達(dá)量不斷增強(qiáng)，已經(jīng)通過(guò)農(nóng)桿菌浸染法轉(zhuǎn)化不育系，對(duì)陽(yáng)性后代的育性正在鑒定。
　　本論文對(duì)大白菜pol CMS育性相關(guān)的基因進(jìn)行了初步的研究，通過(guò)測(cè)序、產(chǎn)物定位、實(shí)時(shí)定量分析及異位表達(dá)等技術(shù)探討了大白菜pol CMS雄性不育可能產(chǎn)生的機(jī)理，對(duì)候選的育性恢復(fù)基因PPR的結(jié)構(gòu)、功能