大白菜細胞核雄性不育基因定位

1、<p>　　大白菜細胞核復等位雄性不育的遺傳分析及基因定位</p><p>　　肖純梅，張慧，張淑江，李菲，章時蕃，孫日飛*</p><p>　?。ㄖ袊r業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京，100081）</p><p>　　摘要：以大白菜不育材料“939A”為母本，攜帶恢復基因的材料YDQ56A為父本構建隱性雄性不育分離群體F1S4群體，利用混合分組分析法（B

2、SA）對不育基因初定位；同時以“939A”為母本，攜帶保持基因的材料yellow sason為父本構建顯性雄性不育F2分離群體，對不育基因進行遺傳分析及精細定位。結果在F1S4群體中獲得與不育基因連鎖的標記2個，A08_1900和BrID111035,與不育基因分別相距8.8cM和2.5cM，物理距離為804.1kb；F2群體中不育對可育為顯性，不育單株與可育單株分離比經(jīng)卡方檢驗符合3:1，不育基因表現(xiàn)為顯性。通過標記驗證，F(xiàn)2和F1S

3、4兩個群體定位結果一致，均位于A08染色體末端，通過新標記的篩選并定位獲得不育基因其兩側緊密連鎖的標記Br19470306和Br19675586，與不育基因分別相距1.6cM和2.4cM，物理距離205.28kb，其中包含58個基因。F1S4和F2兩個群體定位結果一致，均位于A08染色體末端，該結果為大白菜雄性不育系的利用以及轉育為下一步花粉發(fā)育相關基因篩選及功能驗證奠定了基礎。</p><p>　　關鍵詞：大白

4、菜；雄性不育；花粉發(fā)育；基因定位</p><p>　　GeneticFine Mapping of the Multi-allele Genic Male Sterility Gene in Brassica rapa L. ssp. pekinesis</p><p>　　XIAO Chun-mei, ZHANG Hui, ZHANG Shu-jiang, LI Fei, ZHANG S

5、hi-fan, SUN Ri-fei</p><p>　　(Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)</p><p>　　Abstract: Multi-allele Genic male sterility (GMS) is one of

6、the most important methods for hybridization breeding in Chinese cabbage (Brassica B. rapa L. ssp. pekinensis). We developed a A segregating population F1S4 from a cross between a male sterile line 939A and a fertile lin

7、e YQD56A which contained restoring gene was developed. Bulked segregate analysis (BSA) was used to screen markers linked to the MS gene. At the same time, we get got an an F2 population from a cross of 939A and a fertil&

8、lt;/p><p>　　Key words: Brassica rapa L. ssp. pekinensis; male sterility; anther development; gene mapping</p><p>　　大白菜（Brassica B. rapa L. ssp. pekinensis）是我國重要的蔬菜作物，存在顯著的雜種優(yōu)勢，雄性不育系是育種雜種一代種子生產中應用的主

9、要手段之一。我國對十字花科蔬菜雄性不育遺傳機理的研究起始于20世紀中期理論模型主要有：單基因隱性雄性不育[1]，單基因顯性+微效基因調控的甘藍雄性不育遺傳模式[2]，雙基因互作雄性不育[3]及復等位基因雄性不育[4]等。其中，。鈕心恪等提出單基因隱性雄性不育遺傳模式，利用雄性不育兩用系生產大白菜雜交種，降低了生產成本，克服了原種生活力易退化等困難。方智遠[1]等提出單基因顯性+微效基因調控的甘藍雄性不育遺傳模式，配制獲得了不育率接近10

10、0%的雄性不育系。張書芳[2]提出雙基因互作顯性上位作用，由此配制出了100%的雄性不育系，魏毓棠提出細胞核主效基因顯性抑制及微效基因修飾的遺傳模式，這與雙基因互作顯性上位有許多相似之處，都認為不育為顯性，且都將不育性歸結于兩對主效基因的互作。在此基礎上，馮輝等[4]提出的大白菜復等位基因雄性不育遺傳模式認為，。該位點有三個等位基因即恢復基因（Msf）、不育基因（Ms）、保持基因（ms），三個</p><p>　

11、　以復等位基因雄性不育遺傳模式為基礎提出的轉育模式已成功應用于白菜品種選育上并成功選育出卵圓生態(tài)型大白菜核基因雄性不育系[5]。但是利用該模式在轉育過程中，通過表型進行基因型判定十分復雜且周期長。利用分子標記進行輔助選擇（MAS）可加快選育速度。分子標記與基因的距離是制約其準確性的關鍵因素之一，選擇緊密連鎖的標記或基因內部的標記是成功應用MAS的前提[6] -[8]。Miao等[7]開發(fā)4個與隱性雄性不育基因連鎖的STS標記；Ying等

12、[8]找到4個與小白菜細胞核隱性雄性不育恢復基因連鎖的AFLP標記，并成功轉化為STS標記；沈向群等[9]篩選到一個與大白菜育性恢復基因連鎖的RAPD標記；張淑江等[10]找到了一個與細胞核顯性雄性不育連鎖的RAPD標記，并成功轉化為SCAR標記，遺傳距離2.61cM；馮輝等篩選到2個位于不育基因Ms同一側的SSR標記，最近遺傳距離4.95cM；袁鶴等[11]利用初級三體獲得一個距離不育基因1.2cM的AFLP標記，將雄性不育基因定位在

13、A04染色體的著絲粒附近；劉志勇、馮輝等[12]采用BSA法獲得與大白菜雄性不育基因MS連鎖的3個AFLP標記，并將其轉化</p><p>　　通過前人的研究，已獲得多個與育性基因連鎖的標記如表1。其中，張慧等[15][16]于大白菜不育材料“939A”中發(fā)現(xiàn)一新的位于A08染色體上的雄性不育位點，與15個大白菜高代自交系雜交結果表明，該位點屬于復等位雄性不育類型，并找到了一個SRAP標記，將該基因定位于A08染

14、色體上。。但</p><p>　　目前多采用一、二代分子標記（AFLP、RFLP、RAPD、SSR），缺乏精細定位結果及候選基因的分析。因此有必要繼續(xù)開展大白菜雄性不育基因的定位研究，為分子標記輔助育種奠定基礎。本試驗在張慧等[15][16]研究的基礎上，利用該不育材料構建F2代群體，通過分析驗證不育基因的遺傳規(guī)律，BSA法篩選InDel及SSR標記精細定位該不育基因，并對候選基因進行初步篩選，為該不育基因的克隆

15、及其參與的花粉發(fā)育機理研究及大白菜雄性不育生產利用奠定基礎。</p><p>　　表1 與大白菜育性連鎖的標記</p><p>　　Table 1 Markers linked to sterility gens </p><p><b>　　材料與方法</b></p><p><b>　　1.1 試驗材料&l

16、t;/b></p><p>　　供試材料939A是由田間育性突變材料構建的？選育的大白菜雄性不育系。以此不育材料為母本，構建了分離群體。群體Ⅰ選用張慧等[15]構建的F1S4群體；群體Ⅱ以印度油用型白菜yellow sarson為父本，939A為母本，雜交后F1代自交，構建包含297個單株的F2分離群體。所有群體單株定植于中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所北京順義試驗田。</p><p>

17、<b>　　1.2 表型調查</b></p><p>　　在大白菜開花期對F2代單株育性進行調查，主要包括始花期、盛花期、開花末期三個階段，每階段重復調查3次，每次相隔1天。觀察花瓣、花藥、花絲的形態(tài)及花粉有無并據(jù)此綜合判斷育性。</p><p>　　1.3 顯微鏡觀察花藥內部微觀結構及花粉活性</p><p>　　大白菜花期上午8-10時采集

18、當天開放的花藥。取少量花粉于載玻片上，加上1-2滴1%的醋酸洋紅溶液，蓋上蓋玻片。將載玻片置于顯微鏡下觀察3-5片，每片選擇3-5個視野。</p><p>　　1.4 DNA提取及分離群體分組分析（BSA）</p><p>　　采集白菜群體單株幼嫩葉片，冷凍抽干后，采用改良CTAB法[17]提取植物全基因組DNA，利用Nanodrop檢測濃度及質量。</p><p&g

19、t;　　在群體Ⅰ、群體Ⅱ中分別選取10株不育株及可育株，利用Nanodrop將建池單株的DNA濃度稀釋至50ng.uL-1。采用分離群體分組分析（BSA）法等量混合不育株和可育株DNA，構建不育基因池（S）和可育基因池（F），用于分離群體分組分析。</p><p>　　1.5 不育基因連鎖標記篩選及基因定位</p><p>　　不育基因定位共利用265對InDel和28對SSR標記，其中兩

20、個群體初定位的28對SSR和220對InDel標記引物序列由BRAD（http://brassicadb.org/brad/）網(wǎng)站獲得。45對精細定位InDel引物根據(jù)40份白菜重測序序列，利用Primer5軟件，在白菜A08染色體末端初定位區(qū)域特異設計。所有標記引物序列由生工北京公司合成。</p><p>　　PCR反應體系為10uL，其中包括10×PCR緩沖液，0.25mmol/LdNTPs，1.0

21、umol/L上下游引物，50ng/uL模板DNA，1U Taq。PCR循環(huán)程序為：94℃變性5min，94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸50s，35個循環(huán)。PCR擴增產物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。篩選出的多態(tài)性標記分別在群體Ⅰ和群體Ⅱ中檢測，統(tǒng)計標記多態(tài)性，利用JoinMap4.0軟件進行連鎖分析。</p><p>　　1.6 候選區(qū)域基因的篩選</p><p>　　利用

22、白菜基因組序列信息以及注釋信息（BRAD， http://brassicadb.org/brad/），輔以TAIR及KEGG2數(shù)據(jù)庫信息，對定位區(qū)域進行候選基因預測和分析，尋找影響大白菜花粉發(fā)育過程的相關基因。</p><p><b>　　結果與分析</b></p><p>　　花藥內部微觀結構及花粉活性檢測</p><p>　　育性調查發(fā)現(xiàn)F

23、1代育性性狀調查不穩(wěn)定，受環(huán)境影響，表現(xiàn)為在始花期、盛花期無花粉，但在開花末期卻有少量花粉出現(xiàn)。通過顯微鏡觀察驗證部分該花粉具有活性。F2代單株中，可育單株在始花期、盛花期、開花末期均有花粉；不育單株可分為兩種情況：①單株在始花期、盛花期、開花末期均無花粉②表型與F1代相似。</p><p>　　顯微鏡觀察花藥壓片顯示（如圖1），F(xiàn)1代開花末期出現(xiàn)微量花粉的單株，其少部分花粉有活性，部分花粉形態(tài)畸形。F2代不育株

24、花藥干癟，內部橢圓形的花粉粒很少，染色后顏色淺紅，個別花藥中有成熟花粉粒，但其形態(tài)畸形無活性；可育株花藥飽滿，內部被橢圓形花粉充滿，染色后顏色深紅并有明顯的散粉現(xiàn)象，顯微鏡觀察單個花粉發(fā)現(xiàn)，可育花粉橢圓形，深紅色，活性良好。</p><p>　　通過以上調查和檢測，最終確定F2代中得到可育株83株，不育株214株。</p><p>　　2.21 大白菜雄性不育遺傳規(guī)律分析</p&g

25、t;<p>　　通過前期遺傳學分析[15]，本研究中的雄性不育基因符合復等位遺傳假說。群體Ⅰ中，育性分離比率符合3:1，不育基因表現(xiàn)為隱性。群體Ⅱ中，939A不育株與yellow sarson雜交，F(xiàn)1代表現(xiàn)不育，說明yellow sarson育性基因型為保持基因 msms（圖1）。但盛花期后F1代部分單株表現(xiàn)環(huán)境敏感，出現(xiàn)微量花粉，利用微量花粉，進行F1代自交，獲得F2代297個單株，其中83株為可育株，214株為不育株

26、，育性表現(xiàn)為1:3分離（χ2=1.3749<χ20.05=3.84），證明F1代基因型為Msms。， 表現(xiàn)為不育但在該群體中育性受環(huán)境影響。</p><p>　　Ms為不育基因，ms為育性保持基因</p><p>　　Ms is the male sterile gene and ms is the maintained sterility gene</p><p

27、>　　圖21 大白菜細胞核顯性雄性不育系遺傳模式</p><p>　　Fig.21 tThe genetic model inheritance pattern of dDominant genic male sterile gene</p><p>　　2.2 花藥內部微觀結構及花粉活性檢測</p><p>　　顯微鏡觀察花藥壓片顯示（如圖2），不育株花藥

28、干癟，內部橢圓形的花粉粒很少，染色后顏色淺紅，個別花藥中有成熟花粉粒，但其形態(tài)畸形無活性；可育株花藥飽滿，內部被橢圓形花粉充滿，染色后顏色深紅并有明顯的散粉現(xiàn)象，顯微鏡觀察單個花粉發(fā)現(xiàn)，可育花粉橢圓形，深紅色，活性良好。F1代有活性花粉量介于可育株與不育株之間，染色后發(fā)現(xiàn)部分花粉形態(tài)畸形。</p><p>　　2.3 大白菜雄性不育基因定位</p><p>　　經(jīng)BSA在群體Ⅰ不育池及可育

29、池間共篩選了88對InDel引物，發(fā)現(xiàn)3對InDel（BrID111035、A08_1875及A08_1900 ）在兩池及建池單株間表現(xiàn)出多態(tài)性。用3對InDel標記檢測F1S4群體的145個單株，利用Joinmap4.0分析其連鎖關系發(fā)現(xiàn)，這3個InDel標記分別位于不育基因兩側，距離不育基因2.5 cM、8.8 cM、14.2cM。通過這3個InDel標記的序列比對，將不育基因定位于A08染色體末端，與其緊密連鎖的標記為BrID11

30、1035、A08_1900，兩標記間的遺傳距離為11.3cM，物理距離為804kb。</p><p>　　A-C:不育株花藥壓片、醋酸洋紅染色后內部結構和花粉數(shù)及花粉活性 D-F:可育株花藥壓片、醋酸洋紅染色后內部結構和花粉數(shù)及花粉活性 G-I: F1代環(huán)境敏感型單株盛花期后花藥壓片、醋酸洋紅染色后內部結構和花粉數(shù)及花粉活性</p><p>　　A-C: pollen number a

31、nd activity in sterile individual D-F: pollen number and activity in fertile individual G-I: pollen number and activity in F1 later flowering stage.</p><p>　　圖12 不育株和可育株花粉活性鑒定</p><p>　　Fig.12

32、pollen activity identification in sterile and fertile plant</p><p>　　群體Ⅰ中有多態(tài)的三對標記在群體Ⅱ中驗證均沒有多態(tài)性，根據(jù)大白菜不育基因Ms的初定位結果，在群體Ⅱ的不育池及可育池間共篩選位于A08染色體上的149對InDel引物和28對SSR引物，其中21對InDel引物及2對SSR引物表現(xiàn)出多態(tài)性。經(jīng)建池單株驗證后發(fā)現(xiàn)，6個InDel標記

33、（BrID981、BrID991、BrID997、Br11005、Br19747979、Br20023450）及2個SSR標記（SSR 881185、SSR60514）在建池單株間表現(xiàn)出良好的多態(tài)性。用這8對多態(tài)性標記檢測F2群體的297個單株，利用Joinmap4.0分析其連鎖關系，發(fā)現(xiàn)這8個標記與不育基因Ms緊密連鎖，距離最近的兩側標記為SSR60514及Br19747979，通過序列比對，該區(qū)間位于群體Ⅰ定位的兩端標記BrID11

34、1035、A08_1900之間（圖3），群體Ⅰ和群體Ⅱ定位結果一致。</p><p>　　表21 大白菜雄性不育基因連鎖的特異InDel標記?</p><p>　　Table 21 specific InDel markers from male sterile group of Chinese cabbagelinked to male sterility gene</p>

35、<p>　　利用初定位結果，參考大白菜基因組序列分析，在標記SSR60514及Br19747979之間，設計33對InDel標記，找到其中3個標記位于SSR60514及Br19747979標記內部。通過遺傳連鎖分析，不育基因兩側緊密連鎖的分子標記為Br19470306和Br19675586，遺傳連鎖距離分別為1.6cM和2.4cM，兩標記間物理距離為205.28kb（圖3）。</p><p>　　M

36、s為不育基因，Br19470306和Br19675586為不育基因兩側最近的標記</p><p>　　Br19470306 and Br19675586 were the two flanking markers of the male sterile gene(Ms)</p><p>　　圖3 大白菜雄性不育基因遺傳連鎖圖譜</p><p>　　Fig.3 Gen

37、etic map of Male sterile gene (Ms) in Brassica rapa.</p><p>　　2.4 大白菜雄性不育基因候選區(qū)域的？篩選確定</p><p>　　通過白菜基因組序列信息，發(fā)現(xiàn)精細該定位區(qū)域的205kb范圍內共內有58個候選基因。根據(jù)基因組注釋信息，結合TAIR和KEGEG2數(shù)據(jù)庫信息，該58個基因中未知功能基因7個，已知功能基因49個，其中

38、可能影響花粉發(fā)育的基因有：糖代謝相關酶類8個、細胞凋亡及信號轉導相關基因5個、轉錄因子5個，茉莉酸合成相關基因2個，纖維素合成相關基因1個（表32）。</p><p>　　表32 定位區(qū)域內的大白菜基因及擬南芥同源基因</p><p>　　Table 32 Brassica rapa genes in positional region and the homologous genes i

39、n Arabidopsis thaliana in predicted region</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　3.1 大白菜雄性不育遺傳分析</p><p>　　本試驗以939A不育系中的不育株和與其親緣關系較遠的印度油用型白菜yellow sarson雜交，F(xiàn)1代為環(huán)境敏感型，具體表現(xiàn)為：始花期

40、表現(xiàn)不育，花藥短小扁薄，顏色淺白；開花中期和開花后期，隨著溫度升高，其側枝開花，產生微量花粉，花粉活力鑒定為有活性。F2代群體符合單基因顯性遺傳規(guī)律，其中亦出現(xiàn)環(huán)境敏感型單株，但其受環(huán)境影響的程度較F1代明顯降低。</p><p>　　張慧[15]利用939A不育源與15個不同生態(tài)型的大白菜高代自交s系雜交，11個自交系與939A雜交后代表現(xiàn)全可育，4個自交系與939A雜交后代表現(xiàn)全不育，并沒有環(huán)境敏感型單株出現(xiàn)

41、。據(jù)此同樣的，環(huán)境敏感型雄性不育在水稻中也有報道。1973年，石明松發(fā)現(xiàn)“湖北光敏核不育水稻”，各地的育種工作者也對其基因進行遺傳模式研究及定位。梅國志等認為，光敏不育是由光敏基因與育性差異基因協(xié)同作用，并提出了修飾基因強烈影響光敏雄性不育后代表型的報告。據(jù)此推測本試驗群體環(huán)境敏感型單株出現(xiàn)的原因：①該基因在不同的遺傳背景下表現(xiàn)為環(huán)境敏感和環(huán)境穩(wěn)定兩種類型。②該雄性不育受一對主效基因控制但有微效基因起調控作用。</p>&

42、lt;p>　　環(huán)境敏感型雄性不育在小麥[18]、水稻[19] [20]及十字花科其他作物中都有見報道。張建奎[16]通過觀察溫光敏核雄性不育小麥減數(shù)分裂及小孢子發(fā)育過程發(fā)現(xiàn)低溫短日照下小孢子發(fā)育在單核靠邊期停滯，而在高溫長日照下可形成正?？捎娜嘶ǚ哿＃c本試驗結果相似。方智遠[2]等在于一甘藍顯性雄性不育系中發(fā)現(xiàn)環(huán)境敏感型的顯性雄性不育單株，通過自交可以獲得顯性純和的雄性不育單株，利用這一遺傳特點建立了顯性雄性不育基因配制甘藍

43、雜交種的新方法。本試驗群體環(huán)境敏感型單株的出現(xiàn)與甘藍顯性雄性不育表現(xiàn)極其相似，因此，在利用復等位雄性不育轉育模式的同時也可以參考甘藍顯性雄性不育配種方法，選擇經(jīng)濟性狀優(yōu)良的環(huán)境敏感型不育株連續(xù)自交，最終獲得環(huán)境穩(wěn)定的不育株。</p><p>　　針對此種情況，實際生產中可選擇經(jīng)濟性狀優(yōu)良的環(huán)境敏感型不育株連續(xù)自交，最終獲得環(huán)境穩(wěn)定的不育株？。同時，為了減少使用該不育材料時由于環(huán)境敏感帶來的危險性，尚需要進一步研究

44、環(huán)境的各因素與不育基因的具體量化關系？，而且為了避免環(huán)境敏感型單株的出現(xiàn)，還需要進一步的研究環(huán)境敏感基因的遺傳行為。</p><p>　　3.2 大白菜雄性不育基因定位</p><p>　　本試驗利用同一不育源做母本分別構建了隱性和顯性雄性不育分離群體，對一細胞核復等位雄性不育基因進行定位，結果發(fā)現(xiàn)兩個群體的定位區(qū)域一致，位于A08染色體末端，與前人定位的A07[12]和A04[8]染色

45、體著絲粒附近結果不一致，說明該不育基因為一新型雄性不育復等位基因，豐富了雄性不育研究內容。</p><p>　　本試驗利用重測序材料基因組信息設計InDel標記，具有操作簡單，特異性強，準確度高等特點；兩側標記到和不育基因的最近遺傳距離1.6cM，兩標記間物理距離205.28kb，較前人的定位結果更近且可以利用標記將定位區(qū)域比對到大白菜基因組，為下一步基因篩選及功能驗證打下基礎。</p><p

46、>　　3.3 雄性不育基因候選區(qū)域的確定篩選</p><p>　　花粉發(fā)育本身是一個極其復雜的過程，涉及不同的調控及代謝途徑，例如花粉發(fā)育基因、細胞壁形成、細胞信號轉導、細胞程序性死亡、能量代謝、轉錄因子調控等[21]-[23]。目前在植物中已經(jīng)克隆驗證很多雄性不育基因，如擬南芥中SPL、AMS、DYT1、EMS1等[23][24]花粉發(fā)育特異基因及bHLH、MYB、MADS等[23][25]轉錄因子家族

47、。大白菜中通過反向遺傳學鑒定的雄性不育相關基因有BcMF1、BcMF3、BcMF4、BrLTP1、BrPME1等[26][27]。</p><p>　　本試驗定位區(qū)域內共有58個基因，其中可能涉及花粉發(fā)育調控過程的有：能量代謝、細胞凋亡及信號傳導、轉錄因子、茉莉酸合成、纖維素合成等。其中有文獻報道茉莉酸在調控擬南芥雄性器官正常發(fā)育過程中起重要作用，擬南芥茉莉酸合成型突變體及不敏感型突變體coil表現(xiàn)雄性不育[28

48、][29]；MYB轉錄因子與靶基因結合可以導致水稻aid1突變體花藥不開裂，該種花藥不開裂現(xiàn)象在擬南芥中也有報道[30][31]；Raj Chaubal[32]在對玉米ms23和ms32兩個突變體的研究中發(fā)現(xiàn)，纖維素合成與花粉壁形成及絨氈層分化異常有關，兩者均可以導致花粉母細胞減數(shù)分裂Ⅰ過程異常，進而導致雄性不育。也有文獻報道擬南芥中GSK家族中的AtSK11及AtSK12調控花發(fā)育，認為降低其轉錄水平可以加速花器官分生組織發(fā)育及雌蕊形

49、成。ASKβ及ASKθ在花藥中也有很高的表達量；Bra030803是擬南芥中ATSK基因(AT1G09840)的同源基因，是信號傳導途徑中的關鍵蛋白激酶，同時還參與細胞分化和組織形成等過程。據(jù)此推測Bra030803可能是Ms的候選基因之一。為找到該不育基因，還需要進一步的精細定位、候選基因篩選</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1]

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