甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系SaNa-1A敗育的細(xì)胞學(xué)和分子基礎(chǔ).pdf

1、雜種優(yōu)勢(shì)的利用是提高油菜產(chǎn)量的重要手段，細(xì)胞質(zhì)雄性不育作為理想的授粉控制系統(tǒng)之一，為油菜增產(chǎn)作出了巨大的貢獻(xiàn)。油菜CMS類型比較多，根據(jù)其細(xì)胞質(zhì)來(lái)源可分為兩大類:一類是在自然繁殖和進(jìn)化過(guò)程中，由于突變或品種間雜交產(chǎn)生的CMS;另一類是通過(guò)種屬間遠(yuǎn)緣雜交或原生質(zhì)體融合，由核置換或線粒體基因重組而產(chǎn)生的CMS。
　　體細(xì)胞雜交可實(shí)現(xiàn)兩親本間線粒體基因組的重組，是創(chuàng)制新型雄性不育細(xì)胞質(zhì)的最有效方法之一。我們實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)電融合的方法獲得

2、了白芥（Sinapis alba）和甘藍(lán)型油菜（Brassica napu）體細(xì)胞雜種。雜種和甘藍(lán)型油菜品種‘揚(yáng)油6號(hào)’連續(xù)回交，在BC3中獲得1株育性較為徹底的不育株（染色體數(shù)為2n=38），并用不同甘藍(lán)型油菜品種進(jìn)行測(cè)交，篩選獲得保持系SaNa-1B，利用該保持系連續(xù)回交，選育出穩(wěn)定的不育系SaNa-1A。
　　(1)通過(guò)對(duì)不育系和保持系花器官形態(tài)學(xué)的觀察發(fā)現(xiàn)，二者在花器官形態(tài)上存在較明顯的差異，主要表現(xiàn)在不育系雄性生殖器官花

3、藥短小、干癟，表面無(wú)明顯的花粉附著現(xiàn)象，花瓣皺褶，其它器官與保持系無(wú)顯著差異。
　　(2)通過(guò)對(duì)不育系和保持系花藥發(fā)育不同時(shí)期的半薄切片觀察發(fā)現(xiàn)，與正常的花藥發(fā)育過(guò)程相比，不育系除少部分花藥不能形成花粉囊以外，大部分花藥能夠在發(fā)育早期分化形成蝶狀的花粉囊?；ǚ勰讣?xì)胞時(shí)期花藥中各類細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和保持系無(wú)明顯的差別。四分體時(shí)期，不育系四分體結(jié)構(gòu)外包裹著較厚的胼胝質(zhì)，絨氈層液泡化嚴(yán)重。單核早期，不育系小孢子細(xì)胞內(nèi)含物較少，液泡化嚴(yán)重，

4、絨氈層濃染，并與花藥中層細(xì)胞逐漸分離。單核晚期，小孢子彼此粘連在一起形成團(tuán)狀結(jié)構(gòu)，外周被未發(fā)生降解的絨氈層細(xì)胞緊緊包裹著，并將其擠向藥室中央。之后，絨氈層和小孢子團(tuán)一起逐漸降解退化，最終導(dǎo)致無(wú)成熟花粉粒的形成。以上結(jié)果說(shuō)明，不育系SaNa-1A的花藥在四分體時(shí)期就出現(xiàn)異常，小孢子的發(fā)育止步于單核時(shí)期。不育系敗育的主要原因可能是由于絨氈層的正常降解出現(xiàn)障礙，不能及時(shí)的向小孢子的發(fā)育提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)所致。
　　(3)我們對(duì)不育系和保

5、持系花藥發(fā)育不同時(shí)期又進(jìn)行了超微結(jié)構(gòu)比較。結(jié)果顯示，從花粉母細(xì)胞時(shí)期開始，不育系花粉母細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)就出現(xiàn)異常，如花粉母細(xì)胞的體積明顯較小，細(xì)胞核、核仁也要小于保持系，細(xì)胞中出現(xiàn)了許多液泡，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生斷裂，線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生異常。不育系絨氈層細(xì)胞的核仁也明顯小于保持系。四分體時(shí)期，有一些花粉母細(xì)胞仍在進(jìn)行減數(shù)分裂，部分四分體內(nèi)的小孢子液泡化嚴(yán)重，細(xì)胞核、核膜等逐漸降解消失，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器遭到破壞，四分體結(jié)構(gòu)外周被厚厚的胼胝質(zhì)包圍

6、。此時(shí)期的絨氈層細(xì)胞出現(xiàn)了體積較大的液泡，且并未發(fā)生正常的降解，無(wú)法大量的分泌胼胝質(zhì)酶，直至單核時(shí)期，絨氈層才開始出現(xiàn)降解的跡象，并出現(xiàn)包含著孢粉素等物質(zhì)的絨氈層小體等。單核期，小孢子外周雖然有孢粉素的沉積，但是細(xì)胞內(nèi)的線粒體等細(xì)胞器、細(xì)胞核都已消失降解，就剩下體積較大的液泡，至單核晚期，小孢子的細(xì)胞內(nèi)含物全部降解，無(wú)任何物質(zhì)，最后與絨氈層一起降解退化。以上結(jié)果說(shuō)明，不育系花粉母細(xì)胞的發(fā)育一開始就已顯現(xiàn)出缺陷，而絨氈層細(xì)胞降解的延遲和發(fā)

7、育的不正常，又進(jìn)一步抑制了小孢子的發(fā)育，最終導(dǎo)致敗育。
　　(4)通過(guò)對(duì)不育系和保持系不同發(fā)育時(shí)期的花藥及其線粒體的生理生化指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)，不育系敗育前，其離體線粒體中的ROS含量就高于保持系，敗育現(xiàn)象出現(xiàn)后，ROS的積累顯著升高，且遠(yuǎn)大于保持系。對(duì)負(fù)責(zé)清除ROS的抗氧化酶系統(tǒng)的酶活性分析顯示，不育系花藥中的SOD活性隨著敗育的出現(xiàn)先升高后降低，但各時(shí)期的SOD活性均顯著低于保持系，而POD活性卻出現(xiàn)顯著提高，且高于保持系。這些結(jié)果

8、說(shuō)明，不育系敗育出現(xiàn)后，ROS的大量積累誘導(dǎo)了SOD、POD這些抗氧化酶系統(tǒng)的應(yīng)答，但顯然一方面SOD的活性受到了抑制，降低了清除ROS的效率。而另一方面，由于POD是一種具有多重功效的酶，它既能有效清除氧自由基，也能對(duì)植物生長(zhǎng)素的合成產(chǎn)生抑制效應(yīng)，所以不育系花藥中POD活性的提升既是不育系應(yīng)對(duì)ROS積累的應(yīng)答，但同時(shí)也可能對(duì)花藥的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生一定的負(fù)面作用。同時(shí)，不育系中過(guò)量的ROS積累以及抗氧化酶系統(tǒng)的缺陷又進(jìn)一步使膜脂發(fā)生過(guò)氧化，

9、致使花藥中的MDA過(guò)量積累，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。
　　此外，通過(guò)對(duì)不育系和保持系花藥離體線粒體中的F1F0-ATPase活性、ATP含量以及花藥COX活性的比較發(fā)現(xiàn)，不育系花藥離體線粒體中的F1F0-ATPase水解活性隨著發(fā)育的進(jìn)行顯著降低，且低于保持系，而線粒體中ATP的積累也出現(xiàn)類似的變化。不育系花藥中的COX活性也隨著敗育的發(fā)生出現(xiàn)了顯著的降低，但單核期又出現(xiàn)一定的升高趨勢(shì)。以上結(jié)果說(shuō)明，ROS的積累給不育系花藥的發(fā)育造成

10、了較大的影響，繼而使線粒體膜上的呼吸電子傳遞鏈的末端氧化酶的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常，影響了COX和F1F0-ATPase的活性，從而抑制了ATP的合成。再加之不育系花藥中的脯氨酸積累的匱乏，使花藥的生長(zhǎng)和發(fā)育進(jìn)一步遭受抑制，這些生理機(jī)制共同作用，導(dǎo)致了不育系的敗育。
　　(5)通過(guò)DNA片段化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)(TUNEL)研究花藥發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)的PCD事件。結(jié)果顯示，正常的花藥在四分體時(shí)期，絨氈層細(xì)胞會(huì)發(fā)生PCD，并在單核期達(dá)到峰值，至花粉成

11、熟期雜交信號(hào)逐漸開始向外層擴(kuò)展，為下一步成熟花粉粒的釋放做好準(zhǔn)備。對(duì)于不育系，發(fā)現(xiàn)在四分體結(jié)構(gòu)的小孢子中出現(xiàn)了雜交信號(hào)，說(shuō)明此時(shí)小孢子已經(jīng)開始出現(xiàn)PCD現(xiàn)象。而此時(shí)期，不育系的絨氈層細(xì)胞未出現(xiàn)顯著的PCD現(xiàn)象，至單核期才檢測(cè)到少量PCD的發(fā)生。此外，單核期保持系小孢子外周出現(xiàn)的強(qiáng)烈黃綠色的熒光信號(hào)，顯示出大量孢粉素的沉積，而不育系小孢子外的孢粉素沉積較少。這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了前面細(xì)胞學(xué)的研究結(jié)果，結(jié)合生理生化指標(biāo)的分析，表明不育系ROS

12、介導(dǎo)的小孢子的PCD以及絨氈層的發(fā)育異常，是導(dǎo)致SaNa-1A敗育的主要原因。
　　(6)使用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不育系SaNa-1A和保持系SaNa-1B兩個(gè)材料花藥發(fā)育的四分體時(shí)期進(jìn)行了RNA-seq測(cè)序，經(jīng)de novo組裝后分析二者的基因表達(dá)情況，最終共篩選到了9440個(gè)DEGs。對(duì)這些DEGs進(jìn)行進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)有18個(gè)DEGs與線粒體的TCA循環(huán)、電子傳遞鏈和氧化磷酸化等功能有關(guān)，且大部分基因顯著下調(diào)表達(dá)。尤其

13、是編碼ATPase亞基的基因的異常表達(dá)可能是造成不育系敗育現(xiàn)象的根本原因之一。同時(shí)，有14個(gè)DEGs與調(diào)控花藥發(fā)育的過(guò)程有關(guān)，其中除TPD1基因外，其他均在不育系中下調(diào)表達(dá)。這些核基因的異常表達(dá)直接導(dǎo)致了不育系在花藥發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)出與保持系不同的發(fā)育過(guò)程。結(jié)合前人的研究結(jié)果，我們推測(cè)出不育系SaNa-1A發(fā)生敗育的分子機(jī)制模型，即:不育系線粒體基因組發(fā)生突變，產(chǎn)生了新的開放閱讀框，形成嵌合基因，與編碼ATPase的某個(gè)亞基的基因形成共轉(zhuǎn)

14、錄，影響了ATPase的結(jié)構(gòu)，從而使F0F1-ATPase出現(xiàn)功能缺陷，繼而又影響線粒體其他基因（如涉及電子傳遞、氧化磷酸化、TCA循環(huán)、糖代謝等過(guò)程的基因）的表達(dá)，使線粒體的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生障礙。并通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)將不育信號(hào)傳入細(xì)胞核內(nèi)，導(dǎo)致調(diào)控花藥發(fā)育的核基因AG及其下游基因的表達(dá)發(fā)生改變，最終導(dǎo)致SaNa-1A的敗育。
　　此外，我們還發(fā)現(xiàn)了12個(gè)可能與育性恢復(fù)相關(guān)的PPR蛋白。對(duì)上述這些候選基因表達(dá)模式的繼續(xù)深入研究，可以幫助我