棉花胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的精細(xì)定位和物理作圖.pdf

1、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文棉花胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的精細(xì)定位和物理作圖姓名：殷劍美申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：作物遺傳育種指導(dǎo)教師：張?zhí)煺?0050801博士學(xué)位論文棉花胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的精細(xì)定位和物理作圖其插入片段大小，片段平均為130kb，大小范圍從80kb到275kb，957％的片段大于100kb。按棉花基因組大小為2250Mb來算，此丈庫相當(dāng)于57倍棉花基因組大小。隨機(jī)取4個(gè)BAC單克隆，構(gòu)建其O代和100代的NotI和Hindl

2、II的酶切指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)帶型并沒有變化，說明單克隆的穩(wěn)定性至少保持100代。此文庫的構(gòu)建為圖位克隆筋等基因及棉花基因組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。將此文庫按列進(jìn)行混合克隆，即構(gòu)建一級混合克隆文庫，在此基礎(chǔ)上再按列進(jìn)行混合，得到二級混合克隆文庫，它們分別含有16個(gè)和256個(gè)單克隆。利用與觚緊密連鎖的分子標(biāo)記對二級混合克隆文庫進(jìn)行PCR篩選，篩選到陽性混合克隆后j再對一級混合克隆庫進(jìn)行篩選，最終得到陽性單克隆。共13個(gè)標(biāo)記，篩選到50個(gè)陽性單克隆，其

3、中8個(gè)單克隆為2個(gè)標(biāo)記所共有，平均每個(gè)標(biāo)記篩選到38個(gè)陽性單克隆。對所篩選到的陽性單克隆進(jìn)行了NotI和HindIII酶切，得出其大小范圍為80～225kb，平均大小為120kb。根據(jù)所有單克隆的HindIII酶切指紋圖譜，采用Image310b和FPCV72軟件對HindIII酶切圖譜進(jìn)行分析，當(dāng)參數(shù)tolerance值為10，cutoff為1e10時(shí)，構(gòu)建了尺力基因的物理圖譜并將其初步定位于兩個(gè)克隆(Y48和Y42)之間約100kb

4、左右的區(qū)段上。對陽性單克隆的末端進(jìn)行測序，共得到38個(gè)末端序列，根據(jù)序列設(shè)計(jì)了35對引物，通過篩選親本和作圖群體，得到2個(gè)新的分子標(biāo)記與恢復(fù)基因緊密連鎖。育性基因的分離克隆一直是人們關(guān)心的課題，它將對于認(rèn)識不育性機(jī)理，揭示生命現(xiàn)象以及更有效地利用雜種優(yōu)勢都有著十分重要的意義。本研究首先構(gòu)建一個(gè)棉花胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系材料的細(xì)菌人工染色體(BAC)文庫，同時(shí)篩選與螄緊密連鎖的分子標(biāo)記，構(gòu)建恢復(fù)基因緊密連鎖的遺傳圖譜，從而進(jìn)行CMS恢復(fù)基因物