蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育胞質(zhì)和核基因的分子標(biāo)記的開發(fā)及其分子特征.pdf

1、蘿卜是深受世界人民喜愛的根菜類蔬菜。蘿卜的雜種優(yōu)勢(shì)非常顯著，能夠有效地提高產(chǎn)量和改善纖維品質(zhì)。在植物中，細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)是一種不能產(chǎn)生正常功能花粉的母性遺傳性狀，被廣泛地應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)F<,l>代雜種。蘿卜CMS系的細(xì)胞質(zhì)即能導(dǎo)致蘿卜屬植物雄性不育，又能導(dǎo)致蕓薹屬植物雄性不育，而且其CMS不易受環(huán)境條件和不同遺傳背景的影響，從而是十字花科植物中最受關(guān)注的不育細(xì)胞質(zhì)之一。目前已有一種蘿卜CMS及其對(duì)應(yīng)的恢復(fù)位點(diǎn)從蘿卜導(dǎo)入到油菜中

2、，但一些不良的農(nóng)藝性狀隨著恢復(fù)基因的導(dǎo)入而出現(xiàn)。遠(yuǎn)期目標(biāo)在于闡明蘿卜CMS及育性恢復(fù)以及使蘿卜CMS在十字花科雜種優(yōu)勢(shì)育種中得到充分利用。本篇論文中，就蘿卜CMS胞質(zhì)不育和核基因的分子標(biāo)記及其分子特征進(jìn)行了描述。取得的主要研究結(jié)果如下： 獲得了一個(gè)蘿卜CMS系統(tǒng)，該系統(tǒng)由雄性不育系9802A、保持系9802B和恢復(fù)系9802H組成。該不育系花藥外觀皺縮或正常，無可見花粉，而Ogu CMS系花藥外觀皺縮未完全發(fā)育；NWB　CMS系

3、則花藥外觀正常、花藥內(nèi)有部分花粉。不育系9802A和恢復(fù)系9802H雜交產(chǎn)生的F<,l>植株全部表現(xiàn)雄性可育，表明CMS的恢復(fù)表現(xiàn)型是一種顯性性狀。獲得了由300個(gè)單株組成的F<,2>代育性分離群體?？ㄆ椒綔y(cè)驗(yàn)表明分離群體中可育與不育的分離比符合3:1的比例，證明9802A雄性不育的育性恢復(fù)受單一顯性基因控制。 用蘿卜Ogu orf138基因的特異引物組合ORF-F和ORF-R，在蘿卜CMS系9802A總DNA中擴(kuò)增出了一條DN

4、A片段，而在保持系9802B和恢復(fù)系9802H中未擴(kuò)增出任何產(chǎn)物。序列分析表明該片段與特異誘導(dǎo)Ogu CMS相關(guān)基因orf138序列完全一致。該DNA片段可以作為選育蘿卜CMS的分子標(biāo)記。 合成了能夠擴(kuò)增出蘿卜NWB CMS系的特異分子標(biāo)記的引物組合NWB-F和NWB-R，該引物組合在蘿卜CMS保持系9802B和恢復(fù)系9802H總DNA中擴(kuò)增出了單一DNA片段，而在CMS系9802A總DNA中未擴(kuò)增出任何產(chǎn)物。該DNA片段可以作

5、為輔助選育蘿卜CMS保持系的分子標(biāo)記。 采用混合分群分析法和F<,2>代的300個(gè)單株篩選了蘿卜CMS恢復(fù)基因Rfw的RAPD標(biāo)記。對(duì)100條RAPD引物的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行篩選后，發(fā)現(xiàn)RAPD標(biāo)記OPC06-1900與恢復(fù)基因Rfw連鎖。通過分子克隆和核苷酸測(cè)序?qū)⒃揜APD標(biāo)記轉(zhuǎn)換成了顯性的SCAR標(biāo)記SCC06-1894。BLAST搜索表明SCC06-1894與擬南芥和甘藍(lán)硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的對(duì)應(yīng)區(qū)域高度同源。設(shè)計(jì)了等位特異引物，

6、擴(kuò)增出了SCAR標(biāo)記SCC06-415。用F<,2>代的分離群體進(jìn)行PCR分析及序列分析表明SCC06-1894和SCC06-415等位，與Rfwlrfw的遺傳距離為8.0cM。根據(jù)一個(gè)蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因mRNA的序列信息，設(shè)計(jì)了9條引物。采用混合分群分析法篩選這些引物構(gòu)成的引物組合，鑒別出了3個(gè)多態(tài)性帶，這3個(gè)PCR分子標(biāo)記相互間處于相引相，且共分離，與恢復(fù)基因Rfw遺傳距離為1.4 cM。以上的特異的分子標(biāo)記分布在恢復(fù)基因R

7、fw的兩翼有助于選育新的油菜恢復(fù)系。 通過PCR、RT-PCR和測(cè)序發(fā)現(xiàn)了與Ogu CMS恢復(fù)基因Rfo完全一致的mRNA及基因組序列?；谝陨辖Y(jié)果，推斷恢復(fù)基因Rfw與Rio處在蘿卜基因組的不同區(qū)域但緊密連鎖(遺傳距離為1.4 cM)。首次通過分子標(biāo)記手段鑒定出了蘿卜cMS新的恢復(fù)位點(diǎn)。 通過RT-PcR和RACE技術(shù)克隆出了Rfo-like基因的cDNA，推導(dǎo)的氨基酸序列與Rfo蛋白擁有97％的一致性。RT-PCR分

8、析表明Rfo-lidk基因在蘿卜的根、薹、葉、花和嫩莢中均有表達(dá)。Rfo-like基因可能是一個(gè)新的蘿卜CMS恢復(fù)基因。 基于恢復(fù)基因Rfw連鎖分子標(biāo)記SCC06-1894的序列信息，從蘿卜中首次克隆出了推測(cè)的硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因RSultr3.2A，該基因編碼651個(gè)氨基酸的多肽，預(yù)測(cè)的分子量為71701 Da。推測(cè)的氨基酸序列含有硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族所具有的保守結(jié)構(gòu)域，與其它植物硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有很高的同源性，該基因的表達(dá)不受缺

9、硫的影響，在蘿卜的根、薹、葉、花和嫩莢中均有表達(dá)，暗示植物可能需要一個(gè)非調(diào)節(jié)性的組成型表達(dá)的系統(tǒng)。該基因在蘿卜基因組中為單拷貝。通過PCR和測(cè)序獲得了RSultr3.2A的基因組序列信息，與RSultr3.2A的eDNA序列比對(duì)表明該基因擁有12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子組成。RSultr3.2.4是否由蘿卜滲入到油菜中并是否參與控制了對(duì)油菜不利的性狀，有待進(jìn)一步研究。此外，從蘿卜嫩莢中發(fā)現(xiàn)了cDNARSultr3.2B，編碼由499個(gè)氨基