玉米C型細(xì)胞質(zhì)雄性不育的分子生物學(xué)研究.pdf

1、細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS，cytoplasmicmalesterility)足雄性不育中最重要的一種類型，在高等植物中普遍存在。細(xì)胞質(zhì)雄性不育容易實(shí)現(xiàn)不育系、保持系和恢復(fù)系的配套，是當(dāng)前玉米育種中利用的主要類型。玉米細(xì)胞質(zhì)雄性不育的研究和利用已成為玉米育種學(xué)的重要內(nèi)容。依據(jù)核基因?qū)ζ溆曰謴?fù)專效性的不同，玉米CMS可分為3大類型，即T-CMS，C-CMS，S-CMS。T型不育系育性高度穩(wěn)定，但是對(duì)玉米小斑病T小種表現(xiàn)高度的?；腥荆篊型和

2、S型不育系對(duì)玉米小斑病T小種不具有專化感染，但是S型不育系屬于配子體不育類型，對(duì)環(huán)境較敏感，育性穩(wěn)定性較差。所以，C型不育系的利用對(duì)于玉米育種學(xué)具有重要的意義。然而，由于C型不育系發(fā)現(xiàn)較遲，研究利用較晚，與T型和S型相比，其不育機(jī)制研究的還不夠深入。 對(duì)2套同核異質(zhì)不育系及保持系，包括48-2核背景(N48-2、C48-2、T48-2和S48-2)和黃早四核背景(N黃早四、C黃早四、T黃早四和S黃早四)的線粒休DNA進(jìn)行了AFL

3、P分析比較。從選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物中篩選到了一條C48-2所特有的差異條帶C48-223。對(duì)C48-223進(jìn)行克隆、測(cè)序分析表明，它是玉米C型細(xì)胞質(zhì)雄性不育線粒體atp6基因編碼序列的一部分。Southern雜交分析證實(shí)了C48-223在C48-2線粒體基因組上的特異性。Northern結(jié)果顯示，該片段在玉米苗期、四分體時(shí)期和單核期的表達(dá)量呈遞增趨勢(shì)。這說明該差異片段和玉米C型細(xì)胞質(zhì)雄性不育有很高的相關(guān)性。從選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物中篩選到了一條C黃早

4、四所特有的差異條帶C黃早四-1。對(duì)C黃早四-1進(jìn)行克隆、測(cè)序分析表明，它與玉米C型細(xì)胞質(zhì)雄性不育線粒體NADH基因編碼序列的一部分高度同源。本文的研究結(jié)果表明，在單一不育系中出現(xiàn)的特異條帶，有可能是核基因改變線粒體基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄物的加工位點(diǎn)或編輯位點(diǎn)的結(jié)果，而這種改變隨核背景的不同而變化。這些新的特異條帶的出現(xiàn)是否與細(xì)胞質(zhì)雄性不育機(jī)制相關(guān)還有待于進(jìn)一步的研究。 經(jīng)過優(yōu)化，確定適合玉米線粒體蛋白質(zhì)使用的雙向電泳體系為：采用

5、含有7.0molL-1尿素、4％CHAPS、2.0molL-1硫脲、9.0mmolL-1DTT、0.8％兩性電解質(zhì)的裂解液提取線粒體蛋白質(zhì)、12％的分離膠、90000Vh的總聚焦時(shí)間、500μL的上樣最和pH3-10的非線性膠條。采用固相pH梯度-SDSPAGE雙向電泳對(duì)玉米C型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系(C48-2)及其保持系(N48-2)苗期葉片線粒體蛋白質(zhì)、單核期和雙核期花藥線粒體蛋白質(zhì)進(jìn)行了分離，經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)染色，得到了重復(fù)性較好的雙向

6、電泳圖譜。PDQUEST軟件分別在苗期、單核期和雙核期的雙向電泳圖譜上可識(shí)別約280、260、220個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，將其中23個(gè)重復(fù)性比較好且差異表達(dá)在兩倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)采用基質(zhì)輔助激光解析分離飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行了肽指紋圖譜分析，然后用Mascot軟件對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫搜索，其中7個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)得到了鑒定。這7個(gè)蛋白質(zhì)分別是F1-ATP合成酶、ATP合成酶、磷脂酰肌醇-3激酶、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、谷氨酸脫氫酶和電壓依賴陰離子通道蛋白(2個(gè)點(diǎn))。它們