棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育機(jī)理的研究.pdf

1、植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male steriltiy，CMS)是一種不能產(chǎn)生有活力花粉的遺傳現(xiàn)象，屬母性遺傳，在植物雜種優(yōu)勢(shì)利用中具有重要價(jià)值。棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育機(jī)理的相關(guān)研究報(bào)道不是很多，同玉米、水稻等作物雄性不育機(jī)理研究相比，要遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后。因此，開(kāi)展棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育的分子機(jī)理研究，便于更好的利用棉花雜種優(yōu)勢(shì)，具有重要的理論和實(shí)踐意義。哈克尼西棉(Gossypum harknessii Brandegee)細(xì)胞質(zhì)雄

2、性不育是由細(xì)胞質(zhì)基因控制的并可被核恢復(fù)基因抑制的性狀，其花藥在造孢細(xì)胞增殖期就開(kāi)始退化，并在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期達(dá)敗育高峰，進(jìn)而花粉母細(xì)胞不能形成四分體，是一種無(wú)花粉粒的雄性不育。這種雄性細(xì)胞退化早、敗育過(guò)程清晰和凋亡徹底的花藥，既是雜交棉制種的有利條件，也是雄性不育機(jī)理研究的良好材料。 為此，本文以哈克尼西棉雄性不育系和保持系花藥為材料，通過(guò)比較花藥線粒體超微結(jié)構(gòu)、與CMS相關(guān)的線粒體基因序列及基因表達(dá)、線粒體代謝酶類(lèi)的生化

3、分析、線粒體活性氧代謝變化及活性氧清除酶基因的表達(dá)，尋找與棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的基因，并探討細(xì)胞質(zhì)雄性不育產(chǎn)生的可能的分子機(jī)理。研究主要結(jié)果如下： 1．通過(guò)對(duì)棉花不育系和保持系不同發(fā)育時(shí)期花藥的超微結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)現(xiàn)不育系花藥在造孢細(xì)胞增殖期，線粒體就已出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為輕微腫脹，出現(xiàn)電子透明區(qū)。在小孢子母細(xì)胞形成期普遍表現(xiàn)出線粒體體積膨脹、內(nèi)嵴模糊、線粒體空泡化、基質(zhì)淡化等異?，F(xiàn)象，進(jìn)入減數(shù)分裂時(shí)期后，線粒體、液泡等細(xì)胞器逐漸解體

4、、消失。在不育系小孢子發(fā)育不同時(shí)期觀察到無(wú)嵴或嵴不發(fā)達(dá)乃至空泡化的線粒體，這些線粒體不能行使正常代謝功能，以致ATP產(chǎn)生受到限制，能量供應(yīng)不足，最終導(dǎo)致花粉敗育。所以，線粒體的結(jié)構(gòu)異常是棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育系小孢子敗育的重要細(xì)胞學(xué)特征。 2．通過(guò)同源克隆方法，在棉花不育系和保持系線粒體基因組中克隆與CMS相關(guān)的線粒體基因，發(fā)現(xiàn)線粒體atp6、atp9、nad3、nad6、nad9、cob、coxⅠ和coxⅡ基因片段的核苷酸序列在不

5、育系和保持系中沒(méi)有差異，但是線粒體基因coxⅢ在不育系和保持系中存在堿基突變。不育系和保持系線粒體coxⅢ基因全部編碼序列大小沒(méi)有差異，都為798bp，但序列內(nèi)部有5個(gè)堿基發(fā)生了突變，其中3個(gè)堿基突變?cè)斐删幋a的氨基酸發(fā)生了變異。與保持系相比，不育系coxⅢ基因編碼區(qū)的A<'184>、C<'255>、A<'366>、C<'442>和G<'516>分別被替換為C、T、C、A和C。根據(jù)核苷酸序列推導(dǎo)棉花coxⅢ基因編碼265個(gè)氨基酸。不育系c

6、oxⅢ基因推導(dǎo)的氨基酸Ser<'62>、Lys<'122>、Thr<'148>分別被Mg、Asn和Asn替代，而Ser<'85>和Leu<'172>因存在密碼子簡(jiǎn)并現(xiàn)象未發(fā)生變化，不育系在coxⅢ基因上既發(fā)生了錯(cuò)義突變又發(fā)生了無(wú)義突變。經(jīng)同源性分析，發(fā)現(xiàn)棉花不育系coxⅢ基因的核苷酸序列，與擬南芥、油菜、煙草和玉米等coxⅢ基因的核苷酸序列相比，它們的序列同源性都高達(dá)95％。利用RT-PCR和熒光定量RT-PCR方法研究上述與CMS相關(guān)

7、的線粒體基因的表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)花藥發(fā)育過(guò)程中，與CMS相關(guān)的線粒體基因在不育系中的表達(dá)量總體上要低于保持系。在花藥敗育高峰期(花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期)，與CMS相關(guān)的線粒體基因在不育系花藥中的表達(dá)量要顯著低于保持系。 3．通過(guò)對(duì)不育系和保持系葉片、花藥細(xì)胞色素氧化酶的活性和同工酶活性測(cè)定，以及細(xì)胞色素氧化酶的細(xì)胞化學(xué)定位分析，發(fā)現(xiàn)不育系和保持系葉片細(xì)胞色素氧化酶的活性和同工酶活性沒(méi)有明顯差異，而在花藥組織中存在顯著差異。在花藥敗

8、育初期(造孢細(xì)胞增殖期)，不育系花藥中細(xì)胞色素氧化酶活性、同工酶活性和線粒體膜上嗜鋨顆粒的數(shù)量與對(duì)應(yīng)的保持系沒(méi)有顯著差異。在花藥敗育高峰期，不育系花藥細(xì)胞色素氧化酶活性和同工酶活性要顯著低于保持系花藥，不育系花藥線粒體膜和嵴上嗜鋨顆粒的數(shù)量要明顯少于保持系花藥。在花藥敗育后期，不育系花藥細(xì)胞色素氧化酶的活性同保持系相比差異不顯著。棉花不育系細(xì)胞色素氧化酶活性的降低可能與小孢子的敗育和雄性不育的發(fā)生有重要聯(lián)系。 4．通過(guò)測(cè)定不育系

9、、保持系和雜種Fl葉片、花藥及其線粒體活性氧含量、活性氧清除酶的活性，以及抗氧化酶基因的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)葉片活性氧的含量和活性氧清除酶的活性在不育系、保持系和雜種F<,1>中沒(méi)有顯著差異。在花藥敗育初期，不育系花藥中活性氧含量稍高于保持系，活性氧清除酶的活性和抗氧化酶基因的表達(dá)水平與保持系沒(méi)有明顯差異。但在花藥敗育高峰期，不育系花藥一方面活性氧含量極顯著高，另一方面活性氧清除酶活性和抗氧化酶基因的表達(dá)水平極顯著低，活性氧代謝平衡被打破，造

10、成過(guò)量活性氧的積累，產(chǎn)生氧應(yīng)激，對(duì)細(xì)胞發(fā)育產(chǎn)生毒害。在花藥敗育過(guò)程中，雜種F<,1>不同于不育系，始終與保持系一樣保持正常的活性氧含量和穩(wěn)定的抗氧化酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。當(dāng)恢復(fù)基因?qū)氩挥岛?，雜種F<,1>花藥中過(guò)量產(chǎn)生的活性氧能得到清除，這可能是由于核恢復(fù)基因?qū)γ藁ɑㄋ幓钚匝醍a(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡具有調(diào)控作用。 綜上所述，提出哈克尼西棉細(xì)胞質(zhì)雄性不育的可能的機(jī)理，即線粒體呼吸鏈代謝coxⅢ基因的突變和線粒體結(jié)構(gòu)異常，使線粒體電子傳遞

11、途徑不暢，造成花藥中ROS大量產(chǎn)生。由于可育花藥和葉片等其他組織具有較高的活性氧清除酶的活性，另外葉片等其他組織對(duì)活性氧的敏感程度不如花藥雄性細(xì)胞(花粉母細(xì)胞)，所以可育花藥和葉片等其他組織中活性氧水平能保持正常，可育花藥和葉片等其他組織能夠正常發(fā)育。而在不育花藥中，線粒體活性氧的大量產(chǎn)生，同時(shí)線粒體抗氧化酶的活性和基因表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞質(zhì)中活性氧清除酶的活性在花藥敗育階段也很低，導(dǎo)致不育花藥細(xì)胞大量產(chǎn)生的活性氧不能得到及時(shí)、有效的