牦牛Boule基因選擇性剪接體及其DNA甲基化修飾分析與犏牛雄性不育的關(guān)系.pdf

1、本研究以成年健康雄性牦牛和犏牛為研究對象，采用RT-PCR技術(shù)克隆篩選Boule基因的選擇性剪接體，對基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能進行分析，實時熒光定量PCR技術(shù)檢測Boule基因的選擇性剪接體在牦牛和犏牛睪丸組織中的表達水平并且運用同源擴增、PCR克隆測序方法獲得牦牛睪丸組織Boule基因差異甲基化區(qū)（DMR）序列，運用亞硫酸氫鈉測序法檢測了該基因基因DMR甲基化狀態(tài)，為研究犏牛雄性不育與DNA甲基化的關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。

2、　　 1 Boule基因選擇性剪接體的克隆篩選
　　 本試驗根據(jù)黃牛Boule基因序列（NM_001102115）設(shè)計兩對引物，采用RT-PCR技術(shù)著重對Boule基因的開放閱讀框進行擴增，結(jié)果第一對引物擴增出兩條序列長分別為802bp和766bp，第二對引物擴增出的序列長362bp，序列拼接后為兩條序列：1037bp、1001bp，GenBank登錄號分別為：GU187434；GU187435。對這兩條序列進行分析，我們找到

3、了標準的“GT”、“AG”位點，嚴格遵循“GT-AG”剪接規(guī)則。因此我們可以斷定這兩條序列為Boule基因的兩條選擇性剪接體，分別命名為Boule1、Boule2。
　　 2 Boule1、Boule2核苷酸及蛋白序列的生物信息學(xué)分析分析
　　 借助生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)資源和相關(guān)生物學(xué)軟件，篩選出的Boule1的開放閱讀框長849bp，跟正常序列相比缺失了外顯子3的5’端36bp堿基，從而導(dǎo)致開放閱讀框少了12個氨基酸殘基，氨

4、基酸比對發(fā)現(xiàn)剪接部位位于RRM結(jié)構(gòu)域內(nèi)，但是沒有影響到RNP1、RNP2區(qū)域，Boule基因的Reapt區(qū)域未發(fā)生剪接；Boule2的開放閱讀框長813bp，跟正常序列相比缺失了外顯子3的5’端72個bp堿基，從而導(dǎo)致開放閱讀框少了24個氨基酸殘基，氨基酸比對發(fā)現(xiàn)在RRM區(qū)域沒有發(fā)生剪接，選擇性剪接發(fā)上在Boule基因的Reapt區(qū)域.對兩者的蛋白分析發(fā)現(xiàn)，Boule1比Boule2少一個α螺旋，它們的RRM三維結(jié)構(gòu)也證實了這一點，推測

5、Boule1與雄性不育有著密切的關(guān)系。
　　 3牦牛和犏牛睪丸組織中Boule1、Boule2的mRNA表達水平
　　 利用Real-time PCR技術(shù)對牦牛和犏牛睪丸組織中Boule1、Boule2的mRNA的表達進行定量分析，結(jié)果表明牦牛睪丸組織中剪接體Boule1的mRNA表達量高而犏牛的表達量低，其中犏牛與牦牛的表達量差異極顯著（P<0.01）。牦牛睪丸組織中剪接體Boufe2的mRNA表達量高而犏牛的表達量低

6、，其中犏牛與牦牛的表達量差異不顯著（P>0.05）。
　　 4牦牛Boule基因5’端CpG島的分子克隆及序列分析
　　 本實驗根據(jù)黃牛Boule基因序列（NW_001494657.1）設(shè)計引物擴增了牦牛Boule基因的5’端序列，并對牦牛、黃牛和犏牛Boule基因的甲基化水平進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：牦牛Boule基因的5’端存在CpG島，CpG島長2000bp，包含啟動子區(qū)、第一外顯子和第一內(nèi)含子；犏牛Boule5'端D