牦牛Boule基因選擇性剪接體及其DNA甲基化修飾分析與犏牛雄性不育的關(guān)系.pdf

1、本研究以成年健康雄性牦牛和犏牛為研究對(duì)象，采用RT-PCR技術(shù)克隆篩選Boule基因的選擇性剪接體，對(duì)基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測Boule基因的選擇性剪接體在牦牛和犏牛睪丸組織中的表達(dá)水平并且運(yùn)用同源擴(kuò)增、PCR克隆測序方法獲得牦牛睪丸組織Boule基因差異甲基化區(qū)（DMR）序列，運(yùn)用亞硫酸氫鈉測序法檢測了該基因基因DMR甲基化狀態(tài)，為研究犏牛雄性不育與DNA甲基化的關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。

2、　　 1 Boule基因選擇性剪接體的克隆篩選
　　 本試驗(yàn)根據(jù)黃牛Boule基因序列（NM_001102115）設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，采用RT-PCR技術(shù)著重對(duì)Boule基因的開放閱讀框進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果第一對(duì)引物擴(kuò)增出兩條序列長分別為802bp和766bp，第二對(duì)引物擴(kuò)增出的序列長362bp，序列拼接后為兩條序列：1037bp、1001bp，GenBank登錄號(hào)分別為：GU187434；GU187435。對(duì)這兩條序列進(jìn)行分析，我們找到

3、了標(biāo)準(zhǔn)的“GT”、“AG”位點(diǎn)，嚴(yán)格遵循“GT-AG”剪接規(guī)則。因此我們可以斷定這兩條序列為Boule基因的兩條選擇性剪接體，分別命名為Boule1、Boule2。
　　 2 Boule1、Boule2核苷酸及蛋白序列的生物信息學(xué)分析分析
　　 借助生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)資源和相關(guān)生物學(xué)軟件，篩選出的Boule1的開放閱讀框長849bp，跟正常序列相比缺失了外顯子3的5’端36bp堿基，從而導(dǎo)致開放閱讀框少了12個(gè)氨基酸殘基，氨

4、基酸比對(duì)發(fā)現(xiàn)剪接部位位于RRM結(jié)構(gòu)域內(nèi)，但是沒有影響到RNP1、RNP2區(qū)域，Boule基因的Reapt區(qū)域未發(fā)生剪接；Boule2的開放閱讀框長813bp，跟正常序列相比缺失了外顯子3的5’端72個(gè)bp堿基，從而導(dǎo)致開放閱讀框少了24個(gè)氨基酸殘基，氨基酸比對(duì)發(fā)現(xiàn)在RRM區(qū)域沒有發(fā)生剪接，選擇性剪接發(fā)上在Boule基因的Reapt區(qū)域.對(duì)兩者的蛋白分析發(fā)現(xiàn)，Boule1比Boule2少一個(gè)α螺旋，它們的RRM三維結(jié)構(gòu)也證實(shí)了這一點(diǎn)，推測

5、Boule1與雄性不育有著密切的關(guān)系。
　　 3牦牛和犏牛睪丸組織中Boule1、Boule2的mRNA表達(dá)水平
　　 利用Real-time PCR技術(shù)對(duì)牦牛和犏牛睪丸組織中Boule1、Boule2的mRNA的表達(dá)進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明牦牛睪丸組織中剪接體Boule1的mRNA表達(dá)量高而犏牛的表達(dá)量低，其中犏牛與牦牛的表達(dá)量差異極顯著（P<0.01）。牦牛睪丸組織中剪接體Boufe2的mRNA表達(dá)量高而犏牛的表達(dá)量低

6、，其中犏牛與牦牛的表達(dá)量差異不顯著（P>0.05）。
　　 4牦牛Boule基因5’端CpG島的分子克隆及序列分析
　　 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)黃牛Boule基因序列（NW_001494657.1）設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增了牦牛Boule基因的5’端序列，并對(duì)牦牛、黃牛和犏牛Boule基因的甲基化水平進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：牦牛Boule基因的5’端存在CpG島，CpG島長2000bp，包含啟動(dòng)子區(qū)、第一外顯子和第一內(nèi)含子；犏牛Boule5'端D