dna甲基化和腫瘤的關系

1、DNA 甲基化與腫瘤,一、DNA甲基化與基因表達,5-甲基胞嘧啶是天然存在的修飾堿基，甲基化的mCpG ，在DNA 雙鏈中對稱出現(xiàn)。哺乳類動物基因組約60 %的表達基因5′端啟動子存在未被甲基化的CpG島,而啟動子區(qū)域外的CpG島大都為mCpG。正常情況下，非活化的X染色體、印跡基因等的啟動子區(qū)域的CpG島為甲基化狀態(tài)，而看家基因的CpG島則是去甲基化狀態(tài)。DNA 甲基化狀態(tài)與基因表達呈負相關。其調(diào)控作用主要在轉錄水平抑制基因表達。

2、,經(jīng)過亞硫酸鹽處理后的DNA中胞嘧啶（C）轉變?yōu)樾叵汆奏ぃ═）,但是甲基化的中的CpG二核苷酸C未轉變?yōu)門，而無甲基化的CpG二核苷酸則發(fā)生這種轉變，由此可以推斷DNA是否發(fā)生甲基化。,DNA甲基化的檢測方法,TATAGGGCGAATTGGGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTGCCCTTTAGTATTGTTTGGTGAAATGGTACGTGTTTATAATTTTAG

3、TTATTTAGGAGGTTGAGGTAGGAGGATTTTTTGAGTTTAGGAGTTTAAGTTTAGTTTGGGTAATATAGTTTAGTGGTTATATTAAAAAAAGTAAAATAGTCGGGCGCGGTGGTTTACGTTTGTAATTTTAGTATTTTGGGAGGTCGAGGCGGGTGGATTACGAGGTTAGGAGGTTGAGATTATTTTAAGGGCAAT,DNA 甲基化抑制基因轉錄的分子機制 ①DNA

4、 雙螺旋結構的大溝為DNA 與多種轉錄因子的作用部位，mCpG的甲基化胞嘧啶突入大溝，抑制轉錄因子的結合而抑制轉錄。 ②mCpG激活阻遏蛋白因子，如DMAP1、TSG101、Mi2等，通過阻遏蛋白因子的作用抑制轉錄。③DNA甲基化與組蛋白乙?；难芯堪l(fā)現(xiàn)，組蛋白H3、H4 的賴氨酸去乙?；髱ж撾姾?與帶正電荷的DNA結合更緊密,不利于轉錄過程中的聚合物解聚，從而抑制基因轉錄。甲基化的CpG 結合蛋白(MeCPs) 與DNA的mCp

5、G結合,并與組氨酸去乙酰化酶(HDAC) 形成復合物共同抑制轉錄。,二、DNA甲基化與腫瘤,以往的研究認為癌基因激活、抑癌基因失活主要是基因突變、缺失導致的DNA 序列改變。在腫瘤研究中，檢測到許多腫瘤的重要基因并未發(fā)生突變、缺失， 基因表達的異常主要通過DNA 甲基化實現(xiàn)。癌基因的去甲基化和抑癌基因的甲基化狀態(tài)，可導致癌基因激活、抑癌基因的失活。癌基因的低甲基化和抑癌基因的高甲基化改變是腫瘤細胞的一個重要特征。 DNA 甲基化狀態(tài)

6、的改變導致基因結構和功能的異常，與腫瘤發(fā)生的關系是近年來研究的熱點。,DNA甲基化的異常與基因突變、缺失等基因組異常也有密切的關系甲基化異?？赡芡ㄟ^以下途徑導致的基因不穩(wěn)定:①DNA甲基化使基因突變率升高,5-甲基胞嘧啶可自發(fā)脫氨形成胸腺嘧啶,這一頻率高于胞嘧啶轉變?yōu)槟蜞奏さ念l率,并常導致C →T 突變。p53、Rb、c-H-ras-1基因中均發(fā)現(xiàn)該類型突變。②啟動子甲基化使一些重要的基因漸成失活,傾向基因不穩(wěn)定。③腫瘤的一個重

7、要特征是DNA啟動子局部甲基化增強的同時,基因組總甲基化水平卻低于正常細胞。 基因組總甲基化水平低也是基因不穩(wěn)定的原因之一。,三、乳腺癌中基因的甲基化,1. ER基因　ER的表達與否是乳腺癌激素治療的一個腫瘤標記物。 ER基因啟動子和1號外顯子上分布有CpG島。乳腺癌中ER失表達是經(jīng)常性事件,約1/3的乳腺癌患者初診時ER表達陰性；相當一部分的乳腺癌患者隨著腫瘤病情的進展, ER由陽性變成陰性。 基因組的改變, 在ER基

8、因失表達中作用不大。近來的研究認為, ER基因的甲基化異常是其失活的主要機制。,應用Southern 印跡雜交及MS-PCR法研究,顯示在正常乳腺組織和ER表達陽性的腫瘤細胞株,如MCF-7、T47-D、ZR75-1 均未檢測到啟動子的高甲基化,而在原發(fā)性乳腺癌和許多ER陰性的乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468、Hs578t 中,近50 %的ER啟動子高甲基化。可見,DNA甲基化在乳腺癌的ER基

9、因失活中起著十分重要的作用。一系列乳腺癌細胞株中DNA甲基轉移酶1 (DNMT1) 的活性水平檢測結果顯示, ER陰性的乳腺癌細胞株和ER 陽性的比較， DNMT1的表達水平無論RNA 水平或是蛋白水平都顯著升高。ER陰性的乳腺癌DNMT1在整個細胞周期都表達,ER陽性的細胞株則DNMT1多數(shù)出現(xiàn)于S 期。,,2.PR 基因,PR 基因1號外顯子上分布有CpG島。該基因編碼兩種同源性的蛋白質(zhì)hPRa和hPRb。二者的區(qū)別在于N-末端序

10、列和生物活性。hPRb的轉錄需要ER激活,而hPRa不必。Southern印跡雜交及MS-PCR法分析PR表達陰性的原發(fā)性乳腺癌及乳腺癌細胞株,約40%的PR基因啟動子甲基化。應用DNMT1抑制劑5-aza-Dc和雌激素作用于PR陰性的乳腺癌細胞株MSA-MB-231, PR基因啟動子部分去甲基化且基因重新表達。,3. BRCA1基因　 BRCA1 基因于1994年最早報道, 為具有遺傳傾向的乳腺癌、卵巢癌的易感基因,在乳腺癌中

11、最主要的改變形式為等位基因雜合型缺失和突變。目前的研究認為,在約50%的遺傳性乳腺癌中，BRCA1基因的可遺傳性突變是主要的分子機制。 散發(fā)性乳腺癌病例中,BRCA1基因突變罕見。DNA甲基化機制可以合理地解釋散發(fā)性乳腺癌的BRCA1基因轉錄與翻譯水平異常。應用Southern印跡和甲基化敏感特異單鏈構象分析法(MS-SSCA法)分析散發(fā)性乳腺癌中BRCA1基因啟動子甲基化情況,11～24.2%的病例的BRCA1基因啟動子高度甲基

12、化。在散發(fā)型乳腺癌中,甲基化改變是BRCA1基因失表達的重要機制之一。,4.上皮鈣黏附蛋白( E-cadherin) 黏附分子的異常，使細胞和細胞間失去黏附作用，在腫瘤的轉移和侵潤中起關鍵作用。 E-cadherin是一種重要的鈣依賴性的黏附分子, 該蛋白在上皮細胞之間起著黏附及維持組織結構完整性的作用。正常上皮中該蛋白在細胞邊緣區(qū)呈強陽性表達,而在大多數(shù)腫瘤中表達異常。該蛋白的表達與腫瘤的浸潤、轉移呈負相關。,基因的突

13、變、缺失可以解釋部分E-cadherin失表達,但是在約50%的原發(fā)性乳腺癌和乳腺癌細胞株MDA-MB-435中未檢測到基因的突變、缺失,應用MS-PCR法卻發(fā)現(xiàn)E-cadherin基因5′端CpG的高甲基化現(xiàn)象,表明E-cadherin基因啟動子甲基化與該基因失活密切相關。乳腺原位導管癌中E-cadherin啟動子30%甲基化,而轉移病灶上升到60% ,提示E-cadherin基因的甲基化情況與腫瘤的惡性程度相關。研究顯示口部鱗癌淋

14、巴結轉移細胞系的E-cadherin的低表達和甲基化有關。,5.P16INK4a/CDKN2A/MTS,DNA 甲基化在抑癌基因失活中起著重要的作用。P16INK4a 編碼的蛋白是細胞周期依賴性激酶4 的抑制物(CDKI4) ,通過Rb蛋白的磷酸化/去磷酸化作用調(diào)節(jié)細胞G1 →S 期的轉化。該基因轉錄產(chǎn)物是P16INK4a與P19ARF 兩種蛋白。P16INK4a失活存在于大多數(shù)腫瘤中,但是乳腺癌中純合性缺失、點突變極低，分別為1.9%

15、和1.0%。有20%～30%的原發(fā)性乳腺癌及乳腺癌細胞株T47-D、HMECs、ZR75-1檢測到5′端啟動子和1號外顯子的甲基化情況。在40例浸潤性導管癌占30%發(fā)生P16INK4a基因甲基化，與腫瘤分級、淋巴結轉移有關。,6.候選抑癌基因脾酪氨酸激酶syk啟動子甲基化與乳腺癌發(fā)生和轉移的關系,在細胞的信號傳導途徑中,酪氨酸激酶起著很重要的作用。syk在造血細胞上廣泛表達, 作為信號傳導過程中一個影響因子而被廣泛研究。B 細胞抗原受體

16、(BcR)激活以后,依賴syk 的信號傳導途徑調(diào)節(jié)B 細胞的克隆表達, 分化和凋亡。磷脂酶C(PLC)-γ2 和磷脂酰肌醇3 激酶(PI3-K) 是syk 的關鍵靶位。B 細胞內(nèi)PLC-γ2 syk的磷酸化導致ERK 和JNK激酶活性的下降,相反,通過syk 介導Akt 激活可致PI3-K磷酸化。國外研究認為syk,在T 細胞分化成熟過程中也起著很重要的作用采用。,syk 也可使微管的α-微管蛋白亞基磷酸化,α-微管蛋白亞基磷酸化有調(diào)節(jié)

17、微管細胞骨架的功能,而微管細胞骨架是作為信號復合物裝配的基礎。RT-PCR和 MS-PCR檢測了40例乳腺癌組織癌旁組織及15 例乳腺纖維瘤組織中syk基因 mRNA 的表達及syk基因啟動子甲基化情況。syk mRNA 在乳腺正常組織中可檢測到,而在乳腺癌組織中檢測率很低,兩組差異有顯著意義,這表明syk mRNA 的表達缺失可能與乳腺癌的發(fā)生有關。同時，有淋巴結轉移的乳腺癌組織的syk mRNA 的檢出率顯著低于無淋巴結轉移組,這

18、表明syk mRNA 的表達缺失可能與乳腺癌的轉移有關。,研究發(fā)現(xiàn)，轉染了野生型syk 的乳腺癌細胞株有抑制乳腺癌生長和轉移的作用。Okamura 等認為Syk 基因的表達是p53 依賴性的。在腫瘤生成過程中，p53的功能喪失會導致syk 的活性下降,從而使腫瘤易于生成和轉移。Carter 等認為syk 與HER2/ neu 是一對功能相反的抑癌/癌基因，HER2/ neu 的過度表達可誘導血管內(nèi)皮細胞的收縮，從而使腫瘤細胞易于穿過血管

19、屏障發(fā)生轉移，而syk 可抑制HER2/ neu 的收縮血管內(nèi)皮細胞作用，從而抑制腫瘤的轉移。Mahabeleshwar 等研究認為，syk通過抑制磷脂酰肌醇3 (PI-3) 激酶的活性，從而抑制腫瘤細胞的分裂和核因子NF-κB 調(diào)節(jié)的尿激酶型－纖溶酶激活物(u-PA) 的激活分泌,而u-PA 的激活分泌與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移相關。,7. 乳腺癌Nm23-H1 轉移抑制基因,Nm23-H1基因的啟動子有2個 CpG島。DNA

20、甲基化抑制劑 5-Aza-CdR，使11個乳腺癌細胞系中5個細胞系的Nm23-H1 表達升高，其中3個有轉移能力。 Nm23-H1表達升高的同時細胞系體外轉移能力下降。,8. hDAB2IP （人DOC-2/DAB2 interactive protein ）,hDAB2IP 腫瘤抑制基因是 Ras GTPase活化家族的新成員。乳腺癌、前列腺癌中，hDAB2IP 甲基化率高，與表達負相關，甲基化狀態(tài)在 hDAB2IP 基因失活中起關

21、鍵作用。 5-aza-2-deoxycytidine處理 后，基因表達恢復。hDAB2IP 的啟動子區(qū)分成m2a 和 m2b。 m2a區(qū)甲基化異常：25個乳腺癌細胞系中，有11個，占44%。39個原發(fā)乳腺癌中有15個，占 38%； m2b區(qū)甲基化異常：25個乳腺癌細胞系中，有12 個，占48%。39個原發(fā)乳腺癌中有13個，占 33%。 m2b區(qū)甲基化異常和乳腺癌淋巴結轉移有關 。,9.其它基因的甲基化,14-3-3σ基因PHME1

22、(human mammary epithelial 1) 、RARβ2 基因(即視黃酸受體β基因) 等許多關鍵的抑癌基因和生長因子調(diào)節(jié)基因的研究都肯定了DNA 甲基化異常是基因失活的重要機制。這些基因的表達蛋白產(chǎn)物涵蓋了諸如DNA 修復、細胞周期調(diào)節(jié)、細胞生長調(diào)節(jié)、細胞間黏附等各環(huán)節(jié)。,Cyclin D2, RAR-ß, Twist, RASSF1A, HIN-1 在乳腺原發(fā)癌及其淋巴結(25例)、骨（12例）、腦（

23、8例）、肺轉移（10例）的配對標本中檢測Cyclin D2, RAR-ß, Twist, RASSF1A, 和HIN-1 基因的高甲基化情況。與原發(fā)癌相比，轉移癌均有甲基化率高的趨勢，其中淋巴結轉移癌HIN-1 的甲基化狀況有顯著差異，骨、腦、肺轉移癌HIN-1 和 RAR-ß有顯著差異。轉移癌中，上述基因的低表達與其啟動子區(qū)的高甲基化相關。甲基化率高的轉移癌對甲基化抑制劑和組蛋白去已酰酶抑制劑治療敏感。,RASSF

24、1A, APC, DAP-kinaseRAS association domain family protein 1A (RASSF1A), adenomatous polyposis coli (APC), death-associated protein kinase (DAP-kinase) 在原發(fā)導管癌和小葉癌及不同階段和等級的侵潤癌中， RASSF1A, APC, DAP-kinase 的高甲基化34例

25、標本中，32例有一個或多個基因高甲基化，占94%。 RASSF1A 高甲基化22例，占65%；APC 高甲基化15例，占47%；DAP-kinase 高甲基化17例，占50%。,Urokinase （uPA ） uPA 只在高轉移癌(包括乳腺癌)中表達， uPA的高表達和其啟動子低甲基化有關。S-Adenosyl-L-methionine (AdoMet) 抑制去甲基化且促進甲基化，使uPA甲基化，表達降低，顯著抑制腫瘤轉移。

26、 5‘-azacytidine 抑制了AdoMet對uPA的作用。,四.DNA甲基化在乳腺癌診斷中的應用,DNA 甲基化在乳腺癌的診療中至少可在兩方面得到應用。 ①作為臨床診斷,病程監(jiān)控的分子標志物。 ②逆轉基因甲基化作為腫瘤治療的新方向。目前,基因甲基化在乳腺癌診斷中應用的最大問題是確定候選靶基因。,五.DNA甲基化在腫瘤治療中的應用,逆轉DNA甲基化可作為一種治療腫瘤的方向。目前國外正在應用DNMT和HDAC 的抑制劑作這