DNA甲基化檢測(cè)方法的建立和廣西巴馬縣人群白細(xì)胞DNA總體甲基化水平研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開： 第一部分： 目的：分別建立檢測(cè)全基因組DNA總體甲基化水平、以及能對(duì)CD11a基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀況進(jìn)行定量、定位的方法。 方法：HPLC方法1.從流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)等方面優(yōu)化高效液相色譜法檢測(cè)甲基化水平的實(shí)驗(yàn)條件；2.檢測(cè)dC和5-dmC的混合標(biāo)準(zhǔn)品，分別建立兩組分的標(biāo)準(zhǔn)方程；3.分別計(jì)算日內(nèi)精密度、日間精密度和回收率，以評(píng)價(jià)高效液相色譜法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性；4.水解DNA，使之成為d

2、C、5-dmC等脫氧核苷；檢測(cè)DNA水解產(chǎn)物，把峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)方程，分別計(jì)算兩組分的濃度，以5-dmC/(dC+5-dmC)比值代表總體甲基化水平；亞硫酸氫鈉-PCR-測(cè)序法1.確定亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)換模板的濃度和作用時(shí)間，并對(duì)模板進(jìn)行轉(zhuǎn)換；2.保留CD11a基因啟動(dòng)子序列中CG不變，用T替代其他所有的C，以轉(zhuǎn)換后的序列設(shè)計(jì)4對(duì)引物并分段擴(kuò)增之；3.設(shè)計(jì)相應(yīng)的4對(duì)測(cè)序引物以測(cè)序PCR產(chǎn)物，將測(cè)序所獲序列與原序列比對(duì)，確定發(fā)生甲基化的位點(diǎn)，并定

3、量發(fā)生甲基化的頻率。 結(jié)論：本文所建立的高效液相色譜法能夠準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)全基因組總體甲基化水平，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，方法重現(xiàn)性好；亞硫酸氫鈉-PCR-測(cè)序法能夠定量、定位CD11a基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀況，相對(duì)于其他方法，省時(shí)、省標(biāo)本。 第二部分： 目的：探索巴馬縣人群的長(zhǎng)壽現(xiàn)象是否與DNA甲基化有關(guān)，比較該縣人群的總體甲基化水平是否與普通健康人群的一致，分析長(zhǎng)壽地區(qū)人群基因組DNA甲基化水平隨年齡增加而下降的速度是否

4、比一般人群緩慢，以研究長(zhǎng)壽與DNA甲基化之間可能存在的相關(guān)關(guān)系。 方法：1.用非隨機(jī)抽樣法在巴馬的長(zhǎng)壽村落抽取18-103歲的健康個(gè)體為實(shí)驗(yàn)組，共84人；在我校一附院接受例行體檢的健康人群中抽取77人為對(duì)照組，年齡、性別分布與實(shí)驗(yàn)組同；2.抽取研究對(duì)象外周靜脈血2m1，分離白細(xì)胞并提取DNA；3.水解DNA成為脫氧核苷后，使用前文建立的高效液相色譜法檢測(cè)水解產(chǎn)物中的dC和5-dmC濃度，并計(jì)算5-dmC/(dC+5-dmC)比值