DNA甲基化檢測方法的建立和廣西巴馬縣人群白細胞DNA總體甲基化水平研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開： 第一部分： 目的：分別建立檢測全基因組DNA總體甲基化水平、以及能對CD11a基因啟動子區(qū)域甲基化狀況進行定量、定位的方法。 方法：HPLC方法1.從流動相、檢測波長等方面優(yōu)化高效液相色譜法檢測甲基化水平的實驗條件；2.檢測dC和5-dmC的混合標準品，分別建立兩組分的標準方程；3.分別計算日內精密度、日間精密度和回收率，以評價高效液相色譜法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性；4.水解DNA，使之成為d

2、C、5-dmC等脫氧核苷；檢測DNA水解產(chǎn)物，把峰面積代入標準方程，分別計算兩組分的濃度，以5-dmC/(dC+5-dmC)比值代表總體甲基化水平；亞硫酸氫鈉-PCR-測序法1.確定亞硫酸氫鈉轉換模板的濃度和作用時間，并對模板進行轉換；2.保留CD11a基因啟動子序列中CG不變，用T替代其他所有的C，以轉換后的序列設計4對引物并分段擴增之；3.設計相應的4對測序引物以測序PCR產(chǎn)物，將測序所獲序列與原序列比對，確定發(fā)生甲基化的位點，并定

3、量發(fā)生甲基化的頻率。 結論：本文所建立的高效液相色譜法能夠準確靈敏地檢測全基因組總體甲基化水平，檢測結果穩(wěn)定，方法重現(xiàn)性好；亞硫酸氫鈉-PCR-測序法能夠定量、定位CD11a基因啟動子區(qū)域甲基化狀況，相對于其他方法，省時、省標本。 第二部分： 目的：探索巴馬縣人群的長壽現(xiàn)象是否與DNA甲基化有關，比較該縣人群的總體甲基化水平是否與普通健康人群的一致，分析長壽地區(qū)人群基因組DNA甲基化水平隨年齡增加而下降的速度是否

4、比一般人群緩慢，以研究長壽與DNA甲基化之間可能存在的相關關系。 方法：1.用非隨機抽樣法在巴馬的長壽村落抽取18-103歲的健康個體為實驗組，共84人；在我校一附院接受例行體檢的健康人群中抽取77人為對照組，年齡、性別分布與實驗組同；2.抽取研究對象外周靜脈血2m1，分離白細胞并提取DNA；3.水解DNA成為脫氧核苷后，使用前文建立的高效液相色譜法檢測水解產(chǎn)物中的dC和5-dmC濃度，并計算5-dmC/(dC+5-dmC)比值