基于生物芯片的DNA測(cè)序以及DNA甲基化檢測(cè)方法的研究.pdf

1、生物芯片是一種高通量的工具，可以一次性對(duì)大量序列進(jìn)行檢測(cè)和基因分析，能解決傳統(tǒng)的核酸印跡雜交操作復(fù)雜、成本高、效率低等缺點(diǎn)。
　　 人類基因組計(jì)劃推動(dòng)了DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，合成測(cè)序是其中一種有發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景的測(cè)序方法?；蛐酒c合成測(cè)序相結(jié)合，可以降低測(cè)序成本，并實(shí)現(xiàn)快速以及高通量的測(cè)序。目前新一代測(cè)序技術(shù)還主要存在兩方面的問題：（1）基因組測(cè)序模板制備是以PCR（polymerase chain reaction）為基礎(chǔ)

2、，這種模板制備方法存在擴(kuò)增的偏性；（2）測(cè)序中核酸的讀出采用熒光標(biāo)記核苷酸的延伸，在每步延伸后需要切除熒光以避免熒光的累積。但切除步驟較為復(fù)雜，成本高、耗時(shí)長(zhǎng)，并直接影響測(cè)序長(zhǎng)度。針對(duì)上述兩個(gè)問題，本研究提出兩種解決方案：（1）以滾環(huán)擴(kuò)增為基礎(chǔ)制備模板；（2）用淬滅劑直接對(duì)測(cè)序中的熒光進(jìn)行淬滅。
　　 DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾，DNA的異常甲基化是導(dǎo)致癌癥發(fā)生的重要原因。DNA甲基化的檢測(cè)方法是DNA甲基化研究的基

3、礎(chǔ)，缺少高通量，高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)是阻礙在基因組水平上研究DNA甲基化功能的關(guān)鍵原因。本研究基于亞硫酸氫鹽測(cè)序方法，提出了2種在芯片上進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增制備分子克隆，通過芯片雜交無PCR擴(kuò)增偏性高靈敏度檢測(cè)DNA甲基化的方法。
　　 1.以DABCYL為熒光淬滅劑的DNA測(cè)序研究
　　 熒光淬滅劑DABCYL能夠吸收熒光素等分子的激發(fā)能，通過能量轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)熒光淬滅。本論文提出了一種通過DABCYL淬滅核苷酸上熒光的合成測(cè)序方法，

4、并對(duì)熒光淬滅的條件進(jìn)行了優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)醛基修飾的玻片用0.1 mol/1的DABCYL在40℃時(shí)進(jìn)行5分鐘處理，對(duì)于4種常用于核酸標(biāo)記的熒光（FITC、Cy3、Cy5和TAMAR）的淬滅效率都在99％以上；熒光焠滅后再延伸效率在90％以上。熒光光譜研究發(fā)現(xiàn)在上述4種熒光基團(tuán)中DABCYL對(duì)于Cy5的淬滅效率最低。實(shí)驗(yàn)表明，采用以DABCYL為熒光焠滅劑的測(cè)序方法可測(cè)出17個(gè)堿基。
　　 2.以過氧化氫為淬滅劑對(duì)基于單引物滾環(huán)

5、擴(kuò)增DNA測(cè)序模板的測(cè)序研究
　　 本研究提出了一種以滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling Circle Amplication，RCA）為基礎(chǔ)的測(cè)序模板制備方法。通過比較丙烯酰胺修飾的玻片、鏈親和素修飾的玻片以及醛基修飾的玻片，結(jié)果表明丙烯酰胺修飾的玻片對(duì)滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物有較高的固定效率，在玻片上固定滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物能夠進(jìn)行在片延伸。過氧化氫作為一種較強(qiáng)的氧化劑，能破壞熒光素的分子結(jié)構(gòu)，從而淬滅熒光。應(yīng)用過氧化氫作為熒光淬滅劑淬滅測(cè)序中的核酸分子

6、標(biāo)記的熒光。用30％H2O2在30℃處理5分鐘，對(duì)于Cy5的淬滅效率為67％左右。過氧化氫處理后核酸的再延伸效率達(dá)到80％。熒光光譜研究發(fā)現(xiàn)DABCYL對(duì)4種熒光（FITC、Cy3、Cy5和TAMAR）基團(tuán)的淬滅效率從低到高的次序?yàn)镃y3>TAMAR>Cy5>FITC。實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于滾環(huán)擴(kuò)增制備的測(cè)序模板采用過氧化氫作為淬滅劑能夠測(cè)出27個(gè)堿基。
　　 3.以硫酸銅為淬滅劑對(duì)基于超分支滾環(huán)擴(kuò)增制備的DNA測(cè)序模板的測(cè)序研究

7、>　　 為進(jìn)一步提高滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的模板量，提出了在芯片上以超分支滾環(huán)擴(kuò)增（Hyper-branched Rolling Circle Amplication，HRCA）為基礎(chǔ)制備DNA測(cè)序模板的方法。用丙烯酰胺修飾的玻片固定雙引物擴(kuò)增的滾環(huán)產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)表明，雙引物滾環(huán)擴(kuò)增比單引物滾環(huán)擴(kuò)增的產(chǎn)物多，并且HRCA產(chǎn)物制備的測(cè)序模板能夠進(jìn)行在片延伸。應(yīng)用硫酸銅作為熒光淬滅劑淬滅測(cè)序中的熒光，并對(duì)淬滅反應(yīng)的溫度、濃度、時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。研究表明，用

8、0.02 mol/1 CuSO4在30℃時(shí)對(duì)丙烯酰胺修飾的玻片進(jìn)行5分鐘的處理，對(duì)Cy5的淬滅效率為97％，核酸的再延伸效率為95％。熒光光譜研究發(fā)現(xiàn)硫酸銅對(duì)用于核苷酸標(biāo)記的4種熒光基團(tuán)（FITC、Cy3、Cy5和TAMAR）淬滅效率從低到高的次序依次為TAMAR>Cy3>FITC>Cy5。實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于超分支滾環(huán)擴(kuò)增制備的DNA測(cè)序模板采用硫酸銅為淬滅劑能夠讀出42個(gè)堿基。
　　 4.基于磁珠的超支滾環(huán)擴(kuò)增的甲基化檢測(cè)方法

9、r>　　 本章發(fā)展了基于磁珠的超支滾環(huán)擴(kuò)增的甲基化檢測(cè)方法，采用超支滾環(huán)擴(kuò)增及固相核酸擴(kuò)增技術(shù)將均勻分布在固相載體中的不同類型的單個(gè)單鏈模板環(huán)原位高效地?cái)U(kuò)增出來，并牢固地固定在原來的位置，形成一種高密度的核酸分子克隆微陣列。通過變性電泳，將微陣列芯片上含有多個(gè)相同的核酸片段中未固定的核酸鏈去除，成功地制備出單條鏈分子克隆芯片。把陽性克隆和陰性克隆模板的量分別按照0:1，1：O，1:1的比例混合，進(jìn)行在片擴(kuò)增，用探針雜交。陽性模板環(huán)和陰

10、性模板環(huán)對(duì)應(yīng)的紅色和綠色的點(diǎn)的比例分別接近于0:1，1:0，1:1，這些結(jié)果表明該方法能夠檢測(cè)基因甲基化。
　　 5.基于微乳液滾環(huán)擴(kuò)增的甲基化檢測(cè)方法
　　 在BEAMing（beads，emulsion，amplification，and magnetic）技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展了一種DNA甲基化檢測(cè)和定量分析方法。在乳液中進(jìn)行超支滾環(huán)擴(kuò)增，每個(gè)乳液中至多含有一個(gè)磁珠和一個(gè)模板。陽性模板環(huán)和陰性模板環(huán)的比例分別為0:1，1: