基于甲基化芯片及測(cè)序技術(shù)篩選缺血性腦卒中的DNA甲基化分子標(biāo)志物.pdf

1、背景和目的:
　　腦卒中(Stroke)是一種急性的腦血管疾病，是由于局部血液循環(huán)障礙所導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺損綜合癥，具有死亡率高、發(fā)病率高、致殘率高的特點(diǎn)，是全世界第二大死亡原因，也是成年人致殘的主要原因。
　　腦卒中按照病因可分為缺血性腦卒中（Ischemic Stroke，IS）和出血性腦卒中(Hemorrhagic Stroke，HS)，IS約占腦卒中總數(shù)的87％。在我國，腦血管疾病的死亡率和發(fā)病率顯著高于心血管疾病，因

2、此，腦卒中患者需要大量的社會(huì)關(guān)注和醫(yī)療資源投入，尋找防治缺血性腦卒中的生物標(biāo)志物尤為迫切。
　　Ana M.Gómez-(U)riz的研究小組發(fā)現(xiàn)，在肥胖的缺血性腦卒中患者中，KCNQ1啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平可作為診斷IS的生物標(biāo)志物。周淑宇等人的研究發(fā)現(xiàn)，在缺血性卒中患者中CDKN2B甲基化水平能夠影響主動(dòng)脈弓的鈣化程度。已有大量研究表明，許多疾病以及重要的生物過程受到表觀遺傳的調(diào)控。因此，從DNA甲基化的角度研究其對(duì)缺血性腦卒中的

3、影響為我們提供了新的思路。DNA特定位點(diǎn)的甲基化修飾廣泛存在于原核生物和真核生物中，能引起染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA的穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)的相互作用方式的改變，從而調(diào)控基因的表達(dá)，參與代謝途徑調(diào)節(jié)。DNA的甲基化主要發(fā)生在基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島，其甲基化狀態(tài)的確定可以通過DNA甲基化測(cè)序的方法來實(shí)現(xiàn)。
　　目前，從全基因組水平對(duì)IS的DNA甲基化水平進(jìn)行研究未見有報(bào)道。因此，本課題應(yīng)用Illumina Infinium Me

4、thylation EPIC BeadChip(850K芯片)及MethylTarget（目的區(qū)域甲基化水平測(cè)序），對(duì)IS患者與正常人外周血全基因組甲基化的差異水平進(jìn)行分析，篩選IS患者DNA甲基化水平顯著變化的基因，最終，利用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和挖掘，以期尋找與IS發(fā)生、發(fā)展相關(guān)基因的DNA甲基化分子標(biāo)志物。IS甲基化分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)不僅有助于全面揭示IS發(fā)生的表觀遺傳分子機(jī)制，更重要的是可為IS的預(yù)防、診斷、個(gè)體化治療及預(yù)

5、后提供非常有價(jià)值的線索及可靠的科學(xué)依據(jù)。
　　材料與方法:
　　1.1 缺血性腦卒中患者的篩選
　　根據(jù)WHO發(fā)布的缺血性腦卒中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除其它疾病，自2017年3月至2017年10月，在河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的缺血性腦卒中患者中，按照嚴(yán)格的納入標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行選取，其中:
　　第一步初篩人群包括:3例IS患者，分別是2例男性和1例女性，平均年齡為57歲。
　　第二步驗(yàn)證人群包括:60例IS患者，分別

6、是36例男性和24例女性，平均年齡為55歲。
　　1.2 健康對(duì)照組的選取
　　隨機(jī)收錄與IS組同一時(shí)間段體檢的受試者，其中:
　　第一步初篩人群包括:對(duì)照組為3例，分別是2例男性和1例女性，平均年齡53歲。
　　第二步驗(yàn)證人群包括:對(duì)照組為60例，分別是31例男性和29例女性，平均年齡58歲。
　　1.3 實(shí)驗(yàn)方法
　　1.3.1 利用Illumina850K DNA甲基化芯片對(duì)初篩的3例缺血性腦卒

7、中患者和3例健康對(duì)照者的外周血液樣本進(jìn)行全基因組DNA甲基化位點(diǎn)檢測(cè)。對(duì)比兩組具有顯著差異(p＜0.05)的甲基化位點(diǎn)，并利用數(shù)據(jù)庫:京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)Pathway、GO分析(Gene Ontology Analysis，GO)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，選擇與IS相關(guān)并有DNA甲基化表達(dá)差異的基因。
　　1.3.2 擴(kuò)大樣本量至60例IS

8、樣本與60例健康對(duì)照，進(jìn)行MethylTarget（目的區(qū)域甲基化水平測(cè)序）以驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　1.850K DNA甲基化芯片檢測(cè)得到:622個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的甲基化差異CpG位點(diǎn)，共涉及278個(gè)基因(Diffscore值小于-13或大于13;且Delta Beta大于0.17或小于-0.17，即為差異甲基化基因)。
　　2.DNA目的片段甲基化測(cè)序?qū)?9個(gè)候選基因(ABCA1，ADAMTSL5，COL9A2，ER

9、CC5,TGFBI,ABCG1,ATP10A,CYP2E1,HOXA4,PCDHB7,ARL4C,KLF11,SULF2,ADARB2,GDF15,CDH15,CA MTA1,SMG6,RNF144b)驗(yàn)證后得到ABCA1，ADARB2，ATP10A，CAMTA1，CDH15，COL9A2，TGFB1共計(jì)7個(gè)基因，在病例和對(duì)照組之間的甲基化水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(P-value＜0.05(Ttest)&P-value＜0.05(Ute

10、st)&P-value＜0.05(Logistic))
　　3.目的片段甲基化測(cè)序結(jié)果顯示:CAMTA1在IS患者組較健康對(duì)照組甲基化程度升高，而ABCA1，ADARB2，ATP10A，CDH15，COL9A2，TGFB1在IS患者組較健康對(duì)照組甲基化程度降低。
　　結(jié)論:
　　1.本課題應(yīng)用全基因組甲基化芯片及目的區(qū)域甲基化水平測(cè)序，對(duì)IS患者與正常人外周血全基因組甲基化的差異水平進(jìn)行分析，篩選出ABCA1，ADAR

11、B2，ATP10A，CDH15,COL9A2，TGFB1，CAMTA1共7個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島甲基化水平可能成為缺血性腦卒中的DNA甲基化分子標(biāo)志物。
　　2.通過生物信息學(xué)分析，ADARB2，ABCA1，ATP10A和TGFB1可能分別通過介導(dǎo)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)、磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)以及調(diào)節(jié)基因表達(dá)等功能成為缺血性腦卒中的保護(hù)因素。CDH15，COL9A2，CAMTA1可能通過介導(dǎo)細(xì)胞間粘附作用、參與膠原蛋白的合成與分解等功能而成為缺血性腦卒中