滾環(huán)擴增技術(shù)在DNA甲基化檢測芯片及高通量DNA測序技術(shù)中的應(yīng)用研究.pdf

1、DNA芯片是通過將大量不同的DNA靶分子按照已知順序固定在固相基片（多數(shù)采用玻片）上組成密集的微陣列（Microarray）或陣列(Array)，利用核酸雜交原理對靶核酸進行檢測分析。滾環(huán)擴增技術(shù)(Rolling circle amplification，RCA)是一種恒溫擴增技術(shù)，在DNA、RNA、SNP、細胞原位檢測、全基因組擴增方面有較多的應(yīng)用。異常的DNA甲基化與癌癥及許多其他疾病的發(fā)生密切相關(guān)，發(fā)展高通量和高特異性的DNA甲基

2、化檢測芯片具有重要的臨床應(yīng)用價值。本論文以滾環(huán)擴增技術(shù)為主，發(fā)展了多種基因組DNA甲基化檢測的新的DNA芯片檢測方法。本論文還針對新一代DNA測序技術(shù)中的高密度DNA文庫制備問題，采用滾環(huán)擴增技術(shù)和在片原位鏈替代方法獲得了可用于測序的基因組片段芯片。還進一步地把高密度磁珠微陣列技術(shù)和微流體芯片技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展了一種高密度磁珠的微流體DNA測序芯片。
　　 具體內(nèi)容包括：
　　 1、基于分枝滾環(huán)擴增(HRCA)技術(shù)的特定C

3、pG位點的甲基化檢測芯片。
　　 針對包含酶切位點的特定CpG位點，提出并實現(xiàn)了一套新的基于分枝滾環(huán)擴增原理的樣本處理方案。設(shè)計一個鎖式探針與目標DNA序列在CpG位點雜交，并通過甲基化敏感性內(nèi)切酶和連結(jié)酶對鎖式探針與目標DNA同時進行酶切和連結(jié)。當CpG位點處于甲基化狀態(tài)，鎖式探針能成功地被連接酶環(huán)化，成為HRCA反應(yīng)的環(huán)狀模板。連結(jié)形成的環(huán)狀模板與HRCA反應(yīng)所需的兩個引物雜交后啟動HRCA擴增。將一個引物末端進行丙烯酰胺修

4、飾，可以使HRCA產(chǎn)物固定在丙烯酰胺基片上形成3-維膠基DNA微陣列。通過與CY3標記的探針雜交，即可檢測CpG位點的甲基化狀態(tài)。利用這個方法，我們成功地對位于P15，E-cadherin，hMLHl和MGMT基因上的四個CpG位點的甲基化狀態(tài)進行分析。實驗結(jié)果得到甲基化特異性PCR驗證。研究表明，該方法快速便捷，可用于高通量定性分析基因組DNA中特定CpG位點的甲基化。
　　 2、基于滾環(huán)擴增(RCA)技術(shù)的CpG島甲基化的定

5、量檢測芯片。
　　 為了識別目的基因中的甲基化和未甲基化的CpG位點，樣品DNA首先用亞硫酸氫鹽處理。目標區(qū)域通過PCR擴增后，未甲基化的CpG二核苷轉(zhuǎn)化成TpG；同時甲基化的CpG得到保留。設(shè)計一對鎖式探針，其中一條與CpG位點匹配，另一條與TpG匹配。鎖式探針對與純化的PCR產(chǎn)物雜交，當鎖式探針的兩個末端與PCR產(chǎn)物匹配時，鎖式探針才能被連結(jié)，并形成RCA反應(yīng)所需的環(huán)狀模版。這樣，通過我們設(shè)計的一對鎖式探針，把原目標基因中C

6、pG位點甲基化狀態(tài)的信息用對應(yīng)的環(huán)狀模版所表述出來，并在下一步的RCA反應(yīng)中被放大。連結(jié)的鎖式探針與RCA通用引物雜交后，在Φ29DNA聚合酶作用下，通過RCA反應(yīng)進行擴增。RCA產(chǎn)物固定在玻片上形成DNA微陣列。DNA微陣列與通用的CY3-CY5雙色探針對進行雜交。而這兩種通用探針分別針對甲基化和非甲基化而設(shè)計的，通過雜交產(chǎn)生的兩種熒光強度的比值可以用來檢測樣本中的甲基化狀態(tài)。利用這個方法，我們成功地對位于P16和IGFBP7基因上的

7、CpG島的甲基化狀態(tài)進行了定量分析，實驗結(jié)果得到甲基化特異性PCR驗證。實驗結(jié)果表明，這種RCA產(chǎn)物微陣列有望用于CpG島的甲基化狀態(tài)的定量分析。
　　 3、利用滾環(huán)擴增和在片原位鏈替代擴增來平行展示基因組片段。
　　 高通量測序技術(shù)，要求在一個芯片大小的面積上，同時進行上百萬個大規(guī)模平行的測序反應(yīng)以獲得極高的測序通量。因此只有將上百萬個待測基因組DNA片段平行地展示于芯片，形成高密度的DNA測序芯片，才能滿足這種高通量

8、測序的要求。我們利用Φ29 DNA聚合酶進行兩步擴增從而在玻片上產(chǎn)生大量的DNA克隆群落，這些克隆群落可以實現(xiàn)基因組DNA片段在玻片上的平行展示。本研究中，在φ29 DNA聚合酶作用下，基因組DNA片段先以RCA的方式在液相中擴增，然后再以鏈替代反應(yīng)的方式在玻片上進一步擴增。利用這個方法產(chǎn)生的DNA克隆群落成功地實現(xiàn)了T7基因組片段在玻片上的平行展示。這些DNA克隆群落可以成功地用雜交或熒光-dNTP進行識別，被展示的DNA片段和背景熒

9、光信號有明顯的區(qū)別。本方案有較好的重現(xiàn)性，用本方案產(chǎn)生的DNA克隆群落有望用于高通量測序。
　　 4、利用微流體技術(shù)和磁珠陣列制作高密度測序芯片。
　　 通過磁珠乳液PCR可以制備出表面帶大量DNA片段克隆的磁珠，這種克隆磁珠已經(jīng)成功用于制備高密度測序芯片。但現(xiàn)行方案制備的磁珠測序芯片用于高通量測序時，在測序過程中對試劑的消耗量非常大。我們設(shè)計了微流體芯片，并將帶有DNA片段克隆的磁珠以共價結(jié)合的方式，固定于微流道中形成