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1、DNA甲基化是基因組中的一種重要的表觀遺傳修飾,在原核生物和真核生物生長(zhǎng)發(fā)育中扮演重要的角色。異常的DNA甲基化與各種疾病有關(guān),例如癌癥。眾所周知,DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,DNMT)的作用下,以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體,將甲基轉(zhuǎn)移到5'-CG-3'序列(CpG)的胞嘧啶5位碳上,生成5-甲基胞嘧啶,或者將甲基轉(zhuǎn)移到腺嘌呤的6位碳上。因此DNA甲基化水平與甲基轉(zhuǎn)移酶活性息息相關(guān),檢
2、測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性和抑制因子篩選有重要意義。目前,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的檢測(cè)方法主要有放射性標(biāo)記、重硫酸鹽處理、比色和高效液相法等。但這些方法存在一些缺點(diǎn),如放射性標(biāo)記法對(duì)生物組織有傷害,重硫酸鹽處理將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶耗時(shí)長(zhǎng),比色法雖然簡(jiǎn)單,但金納米粒子容易聚沉,高效液相色譜法需要大型儀器成本高。因此,發(fā)展簡(jiǎn)單、快速DNA甲基化和甲基轉(zhuǎn)移酶活性的分析方法非常必要。5-hmC被認(rèn)為是基因中的第六種堿基,主要分布于神經(jīng)元細(xì)胞,小鼠腦細(xì)胞和
3、胚胎干細(xì)胞中。同時(shí),在許多種癌細(xì)胞中它的含量相對(duì)于正常細(xì)胞降低。因此,5-hmC的表達(dá)水平可以作為檢測(cè)癌癥的標(biāo)志物。目前檢測(cè)5-hmC的方法有薄層色譜法、高效液相法、酶催化放射性標(biāo)記法等,但是這些方法都有許多缺點(diǎn)。例如,高效液相法需要大型儀器,酶催化放射性標(biāo)記法傷害生物組織。因此,依然需要發(fā)展一種簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)基因組DNA中5-hmC的方法。本文利用CdS量子點(diǎn)、Bi2S3光電納米材料、生物酶和抗體等,并通過(guò)酶催化放大技術(shù),制備了兩種光
4、電化學(xué)生物傳感器和兩種電化學(xué)生物傳感器,對(duì)甲基轉(zhuǎn)移酶活性進(jìn)行了分析并且對(duì)細(xì)胞中5-hmC的含量進(jìn)行了檢測(cè)。
(1)本文利用Bi2S3光電納米材料和酶催化信號(hào)放大技術(shù)制備了一種用于 M.SssI甲基轉(zhuǎn)移酶活性分析和其抑制因子篩選的光電生物傳感器。5-mC抗體作為識(shí)別單元,SA-AuNPs作為信號(hào)擴(kuò)增單元,ALP作為酶催化單元。在甲基轉(zhuǎn)移酶存在的情況下,發(fā)卡 DNA可以被甲基化。當(dāng)與生物素修飾的DNA雜交后形成雙鏈 DNA(ds-
5、DNA),ds-DNA可以被俘獲到抗體修飾的電極表面,隨后SA-AuNPs和ALP-biotin可以通過(guò)生物素與鏈霉親和素的特異性識(shí)別依次被俘獲到電極表面。堿性磷酸酯酶(ALP)原位催化水解L-抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽產(chǎn)生抗壞血酸分子作為電子供體,從而增強(qiáng)光電信號(hào)。制備的傳感器表現(xiàn)出了很好的靈敏性,對(duì)甲基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)限為0.33 unit/mL。而且,對(duì)抑制劑的篩選證明RG108對(duì)甲基轉(zhuǎn)移酶活性有抑制作用,半數(shù)抑制量為152.54 nM。
6、
(2)基于G-四連體和ExoIII的電化學(xué)傳感器檢測(cè)甲基轉(zhuǎn)移酶活性。首先,探針雙鏈DNA固定到金電極表面,隨后將 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶滴加到電極表面,甲基化后用DpnI切割。這樣甲基化的DNA鏈可以被ExoIII消解釋放富含G的DNA單鏈。在氯化血紅素和鉀離子存在的情況下,其可以形成氯化血紅素/G-四連體結(jié)構(gòu)。氯化血紅素/G-四連體可以在雙氧水存在的情況下催化對(duì)苯二酚生成苯醌。苯醌可以產(chǎn)生較大的電信號(hào)。最后我們用還原石墨烯修飾的
7、金電極作為工作電極進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量。制備的電化學(xué)傳感器展現(xiàn)了較好的靈敏度。對(duì)DAM甲基轉(zhuǎn)移酶的檢測(cè)限為0.31 unit·mL-1。抑制劑的研究表明,表兒茶素能夠抑制DAM甲基轉(zhuǎn)移酶活性,半數(shù)抑制量為157μM。
(3)基于5-hmC抗體,生物素功能化的phos-tag(Phos-tag-biotin)和親和素修飾的堿性磷酸酯酶(avidin-ALP)的電化學(xué)免疫傳感器定量檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中的5-hmC。5-hmC抗體作為識(shí)別單元
8、,Phos-tag-biotin作為連接單元,avidin-ALP作為酶催化信號(hào)擴(kuò)增單元。首先5-羥甲基胞嘧啶脫氧核苷酸被俘獲到抗體修飾的電極表面,之后Phos-tag-biotin通過(guò)與磷酸根的作用俘獲到電極表面。最后,avidin-ALP通過(guò)親和素和生物素的特異性結(jié)合作用固定到電極表面。通過(guò) ALP催化對(duì)硝基苯磷酸二鈉產(chǎn)生電活性分子對(duì)硝基苯酚。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,制備的電化學(xué)免疫傳感器展現(xiàn)出了很好的靈敏度,檢測(cè)限為0.032 nM。而且通
9、過(guò)制備的電化學(xué)免疫傳感器成功的對(duì)乳腺癌細(xì)胞中的5-hmC含量進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)與正常乳腺細(xì)胞比較,5-hmC在乳腺癌細(xì)胞中的含量大量降低。
(4)基于原位產(chǎn)生電子供體和全波長(zhǎng)光作為激發(fā)光的策略制備光電傳感器檢測(cè)5-hmC。首先,通過(guò)酰胺鍵將氨基修飾的探針 DNA固定到羧基修飾的磁性微球表面。在 M.HhaI和半胱胺存在的條件下,含有5-hmC的探針 DNA可以被氨基化。隨后NHS-biotin能夠被標(biāo)記到氨基化的DNA鏈上。隨后
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