恒溫擴增法檢測甲基化酶活性的研究.pdf

1、DNA甲基化是最主要的表觀遺傳方式之一。生物體中基因表達、蛋白質相互作用以及腫瘤的產生發(fā)展等與 DNA甲基化水平和 DNA甲基化酶活性密切相關。發(fā)展簡便、靈敏的甲基化酶檢測新方法對于生化分析和臨床相關疾病的診斷研究具有重要意義。
　　本研究主要內容包括：⑴基于恒溫指數擴增反應（EXPAR）檢測甲基化酶活性。設計了無標記的發(fā)夾探針，該發(fā)夾探針的莖部有 Dam甲基化酶的特異識別序列。當溶液中存在甲基化酶時，發(fā)夾探針被甲基化。然后加入限

2、制性內切酶特異切割發(fā)夾探針，釋放出來的環(huán)部序列可作為引物引發(fā) EXPAR反應。當無甲基化酶時，發(fā)夾探針未被切斷，不能引發(fā) EXPAR反應。最后，EXPAR反應產物利用 DNA特異熒光染料直接檢測，實現了甲基化酶活性的測定。方法簡便、快速、成本低，并可實現抑制甲基化酶活性的藥物篩選，為抗癌藥物的篩選提供了一種新方法。⑵滾環(huán)擴增反應結合水溶性陽離子共軛聚合物均相檢測甲基化酶活性的研究。我們新設計發(fā)夾探針，其在甲基化酶作用下，莖部的酶識別序列

3、被甲基化。再經限制性內切酶切割后，釋放的序列將作為引物引發(fā)滾環(huán)擴增反應（RCA）。在擴增過程中，我們加入熒光素修飾的dUTP（ dUTP-FITC），它隨擴增反應的進行而添加到DNA產物中。當加入PFP后，DNA與PFP通過靜電力結合拉近熒光素與PFP之間的距離，并發(fā)生有效的熒光共振能量轉移（FRET）。當無甲基化酶時，該發(fā)夾探針結構保持完整，不會引發(fā)RCA。溶液中游離的dUTP-FITC經堿性磷酸酶降解，降解產物與PFP相互作用很小，