基于金納米顆粒和發(fā)夾型核酸探針電化學檢測DNA甲基化酶.pdf

1、DNA甲基化是表觀遺傳中最主要的作用方式，其在基因表達調(diào)控、基因組印跡、胚胎發(fā)育、維持正常細胞功能等過程中起著極其重要的作用。人類許多重大疾病如癌癥、遺傳性疾病都與DNA甲基化以及甲基化酶的活性密切相關。因此，研究DNA甲基化過程和分析DNA甲基化酶活性，受到了研究者們的廣泛關注。由于傳統(tǒng)的檢測方法存在耗時、不連續(xù)、大多需要放射性標記等缺點，于是發(fā)展新的簡便、經(jīng)濟、靈敏的甲基化監(jiān)測手段和甲基化酶檢測方法便已成為生化分析和臨床診斷等領域愈

2、加迫切的需求。電化學生物傳感器具有靈敏度高、操作簡便、響應快速、易于微型化、測試費用低等優(yōu)點，在各種目標物的檢測中得到了廣泛的研究和應用，也為DNA甲基化和DNA甲基化酶的研究提供了新的契機。本論文以甲基化酶活性的高靈敏檢測為目標，基于核酸分子探針及納米材料信號放大作用構(gòu)建了不同的電化學生物傳感器，主要包括以下三方面的研究工作：
　　一、基于金納米顆粒信號放大作用的DNA甲基化酶免標記電化學檢測
　　利用DNA功能化金納米顆

3、粒的信號放大作用，發(fā)展了一種便捷、高靈敏電化學檢測Dam甲基化酶活性的新方法。首先在金電極上修飾單鏈DNA，當不存在Dam甲基化酶時，互補DNA修飾的金納米顆粒通過雜交作用，靠近電極表面，此時是“eT OFF”狀態(tài)；當檢測體系中有Dam甲基化酶和Dpn I限制性內(nèi)切酶時，DNA雙鏈被甲基化并切斷，使得金納米顆粒遠離電極表面，電子可以自由傳遞，產(chǎn)生可檢測的電化學信號(eT ON)。金納米顆粒自身的空間位阻作用會阻礙電極表面的電子傳遞，同時

4、，金納米顆粒上修飾有大量帶負電荷的DNA，由于靜電斥力，進一步阻礙帶負電荷的電活性物質(zhì)鐵氰化鉀與電極表面的電子傳遞，從而實現(xiàn)信號的放大。該方法實現(xiàn)了對Dam甲基化酶的特異性檢測，檢測限為0.12U/mL，并且能用于對甲基化酶敏感藥物的篩選。
　　二、基于甲基化響應的發(fā)夾型捕獲探針電化學檢測DNA甲基化酶活性
　　結(jié)合亞甲基藍標記的報告探針和甲基化響應的發(fā)夾型捕獲探針，構(gòu)建了一種靈敏的電化學生物傳感器用于檢測甲基化酶活性。在該

5、方法中，發(fā)夾型捕獲探針的莖部包含甲基化酶識別位點。當甲基化酶不存在時，發(fā)夾型結(jié)構(gòu)保持完整，捕獲探針封閉在其莖部結(jié)構(gòu)中，這阻礙了報告探針與捕獲探針之間的雜交，使得標記在報告探針上的電活性物質(zhì)亞甲基藍不能靠近電極表面，處于“eT OFF”狀態(tài)。而當甲基化酶存在時，該位點被甲基化，進而被限制性內(nèi)切酶切割，使得與報告探針互補的捕獲鏈暴露出來，通過DNA鏈之間的互補配對，報告探針上標記的亞甲基藍靠近電極，從而發(fā)生電子傳遞，產(chǎn)生可測量的電化學信號。

6、以Dam甲基化酶為例，該方法檢測限為0.07U/mL，并且可以實現(xiàn)對甲基化酶的動力學研究及相關抑制劑篩選。
　　三、基于發(fā)夾型探針和G-四聚體結(jié)構(gòu)免標記電化學檢測DNA甲基化酶
　　將電活性物質(zhì)Hemin可以特異性的與富G序列結(jié)合形成具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的G-四聚體這一特性，應用于甲基化酶活性的電化學檢測。設計了甲基化響應的發(fā)夾型探針，其莖部包含甲基化酶的識別位點及一段特異性的富G序列，當甲基化酶不存在時，該序列被封鎖在發(fā)夾型探針的