基于DNA探針的電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、隨著基因工程的迅猛發(fā)展，傳統(tǒng)的分析和檢測(cè)方法已不能滿足當(dāng)前需要，很多新的檢測(cè)器件和分析方法應(yīng)時(shí)而生，電化學(xué)DNA生物傳感器便是其中的一個(gè)。電化學(xué)DNA生物傳感器的原理是檢測(cè)由 DNA探針?biāo)峁┑姆肿幼R(shí)別過(guò)程，然后通過(guò)一個(gè)換能器將測(cè)量結(jié)果轉(zhuǎn)換為可識(shí)別的電化學(xué)信號(hào)[1]。
　　對(duì)特定DNA片段或者小分子蛋白的檢測(cè)在診斷基因相關(guān)疾病、監(jiān)測(cè)環(huán)境和軍事反恐等方面都有十分重要的意義。研究電化學(xué)DNA生物傳感器就是為了滿足對(duì)特定DNA片段或者小

2、分子蛋白的高靈敏度檢測(cè)、高選擇性檢測(cè)和方便快捷檢測(cè)的需要。一般來(lái)說(shuō)，DNA傳感器依據(jù)檢測(cè)手段的不同大致可以分為三類(lèi)：聲學(xué)傳感器、光學(xué)傳感器和電化學(xué)傳感器等。由于電化學(xué)檢測(cè)手段具有高靈敏、低能耗、方便快捷和低成本等特點(diǎn)，使其成為一個(gè)十分活躍的研究領(lǐng)域并得到了迅猛發(fā)展。
　　本文對(duì)DNA生物傳感器進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，以適配體和DNA樹(shù)枝狀聚合物修飾電極并應(yīng)用于8-羥基-2′-脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷和特定序列 DNA的檢測(cè)。主要內(nèi)容包括以下四個(gè)方

3、面：
　　1.免標(biāo)記適配體傳感器的制備及其用于8-羥基-2′-脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷的檢測(cè)
　　基于8-OH-dG適配體Apt在8-OH-dG存在下的構(gòu)象變化制備了一種免標(biāo)記的電化學(xué)生物傳感器，并用于8-羥基-2′-脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷（8-OH-dG）的檢測(cè)。這種方法是將富鳥(niǎo)嘌呤（G）的適配體通過(guò)Au-S鍵自組裝到金電極表面，在8-OH-dG存在下，適配體的構(gòu)象從單鏈結(jié)構(gòu)變成緊密的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，阻礙帶負(fù)電荷的[Fe(CN)6]4-靠近

4、電極表面，使[Fe(CN)6]4-的氧化還原電流強(qiáng)度發(fā)生變化。利用循環(huán)伏安法和交流阻抗法對(duì)適配體傳感器的電化學(xué)行為進(jìn)行了表征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該適配體傳感器的響應(yīng)電流與8-OH-dG的濃度在1.75 nM~3.675μM范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢出限為0.315 nM(S/N=3)。該適配體傳感器有較高地穩(wěn)定性同時(shí)可以避免尿酸的強(qiáng)干擾。
　　2.基于非線性雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的超靈敏電化學(xué)生物傳感器的制備及其對(duì)DNA的檢測(cè)
　　基于非線性雜

5、交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）引發(fā)的DNA樹(shù)枝狀聚合物的鏈?zhǔn)皆鲩L(zhǎng)，構(gòu)建了一種超靈敏的檢測(cè)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定序列 DNA的超靈敏檢測(cè)。當(dāng)目標(biāo)物 DNA（tDNA）存在時(shí)，tDNA引發(fā)非雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，最終自組裝形成樹(shù)枝狀的納米結(jié)構(gòu)。生物素標(biāo)記的雜交鏈捕獲親和素修飾的辣根過(guò)氧化酶（HRP），HRP催化 H2O2氧化3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），在一定程度上提高了電化學(xué)檢測(cè)信號(hào)。該檢測(cè)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了對(duì)tDNA的超靈敏檢測(cè)，檢出限為0.4 fM。

6、另外該傳感器具有較高的選擇性，能夠識(shí)別互補(bǔ)配對(duì)的DNA序列之間的單個(gè)堿基的差異。所以，該方法有可能在與基因有關(guān)的疾病的早期診斷中有較好的應(yīng)用前景。
　　3.基于非線性雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的電化學(xué)生物傳感器的制備及其對(duì)DNA的檢測(cè)
　　針對(duì)辣根過(guò)氧化酶（HRP）受反應(yīng)溫度等影響較大的問(wèn)題，我們制備了一種新的基于非線性雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）吸附三氯化六銨合釕（RuHex）的電化學(xué)DNA傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定序列DNA的超靈敏檢測(cè)。當(dāng)目標(biāo)物

7、DNA（tDNA）存在時(shí)，tDNA引發(fā)非雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，最終自組裝形成樹(shù)枝狀的納米結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)捕獲大量的具有電化學(xué)活性的RuHex，極大程度的提高了電化學(xué)檢測(cè)信號(hào)。該檢測(cè)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了對(duì)tDNA的超靈敏檢測(cè)，檢出限為0.33 fM。另外該傳感器具有較高的選擇性，能夠識(shí)別互補(bǔ)配對(duì)的DNA序列之間的單個(gè)堿基的差異。所以，該方法有望應(yīng)用在與基因有關(guān)的疾病的早期診斷中。
　　4.基于非雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備及其對(duì)DNA的檢

8、測(cè)
　　基于非線性雜化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）引發(fā)的DNA樹(shù)枝狀聚合物的鏈?zhǔn)皆鲩L(zhǎng)，構(gòu)建了一種超靈敏的檢測(cè)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定序列 DNA的超靈敏檢測(cè)。當(dāng)目標(biāo)物 DNA（tDNA）存在時(shí)，tDNA引發(fā)非雜化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，最終自組裝形成樹(shù)枝狀的納米結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)捕獲大量的具有電化學(xué)發(fā)光性能的吡啶釕（Ru(bpy)32+）在一定程度上提高了電化學(xué)檢測(cè)信號(hào)。該檢測(cè)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了對(duì) tDNA的超靈敏檢測(cè)，實(shí)際的檢出限為10 fM。而且該檢測(cè)平臺(tái)具有較高的