基于魯米諾電化學(xué)發(fā)光的生物傳感技術(shù)研究.pdf

1、電化學(xué)發(fā)光或電致化學(xué)發(fā)光分析方法(Electrochemiluminescence,ECL)是指直接利用電化學(xué)反應(yīng)形成激發(fā)態(tài)發(fā)光體而發(fā)光或通過(guò)電解產(chǎn)物之間、電解產(chǎn)物與體系中某組分之間進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生光輻射而實(shí)現(xiàn)分析物測(cè)定的發(fā)光分析技術(shù),是電化學(xué)與化學(xué)發(fā)光分析相結(jié)合的產(chǎn)物。與傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光分析法相比,ECL分析法不僅具有化學(xué)發(fā)光分析法的靈敏度高和線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn),而且在許多方面優(yōu)于化學(xué)發(fā)光分析,包括如:第一,不穩(wěn)定的化學(xué)試劑和中間體在電極

2、表面定量生成,且迅速進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；第二,電化學(xué)反應(yīng)可以通過(guò)改變所施加的電位加以控制,所以可以有選擇地控制化學(xué)反應(yīng)而不需要采取額外的分離手段；第三,電化學(xué)氧化能力是連續(xù)的,在同一化學(xué)條件下可以通過(guò)控制電位加以改變電化學(xué)氧化能力。本論文在全面總結(jié)和論述ECL分析的基本原理、常見(jiàn)ECL體系反應(yīng)機(jī)理以及生物傳感器的基本原理、分類、應(yīng)用等方面的研究等基礎(chǔ)上,進(jìn)行了以下三方面的研究工作：
　　 ⑴魯米諾電化學(xué)發(fā)光體系是基于電化學(xué)氧化魯米

3、諾生成自由基,所生成的自由基不穩(wěn)定,再進(jìn)一步被一些氧化劑氧化產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。雖然ECL分析法具有靈敏度高、線性范圍寬和儀器設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),但是在中性、弱堿性介質(zhì)這樣有利于生物分子保持活性的環(huán)境中,魯米諾的ECL發(fā)光極弱,傳統(tǒng)的魯米諾ECL應(yīng)用多在強(qiáng)堿性介質(zhì)中進(jìn)行。為保持生物分子的活性,考慮利用合理的措施來(lái)有效實(shí)現(xiàn)魯米諾在中性、弱堿性介質(zhì)環(huán)境中的ECL增敏,對(duì)其發(fā)展和應(yīng)用都有很高的學(xué)術(shù)和實(shí)用價(jià)值。在已經(jīng)建立的ECL分析體系的基礎(chǔ)上,探討了納

4、米材料如金溶膠(Au sol)和鉑溶膠(Pt sol)、有機(jī)分子如氯霉素(Chioramphenicol,CAP)和半胱氨酸(Cysteine)、以及介質(zhì)體系如微乳液(Microemulsion)和離子液體(Ion Liquid)在中性、弱堿性介質(zhì)中對(duì)魯米諾ECL的增敏作用,研究中發(fā)現(xiàn)ECL信號(hào)與增敏劑之間均存在可以被實(shí)際應(yīng)用的確定的定量關(guān)系,并探討了各體系的增敏機(jī)理。在此基礎(chǔ)上,采用吸附、自組裝等手段制備了相關(guān)的修飾電極,而且可以有效

5、實(shí)現(xiàn)ECL物質(zhì)魯米諾的固定化,在成功提高檢測(cè)靈敏度的前提下,實(shí)現(xiàn)微量、痕量生物分子(如維生素C、褪黑素、超氧化物歧化酶等)的檢測(cè)。
　　 ⑵在中性或弱堿性介質(zhì)中,對(duì)溶解氧、過(guò)氧化氫(H2O2)、辣根過(guò)氧化氫酶(HRP)／H2O2、黃嘌呤氧化酶(XOD)／次黃嘌呤(Xanthine)、尿酸酶(Uricase)／尿酸(UA)以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)等對(duì)魯米諾電化學(xué)發(fā)光的增敏(或猝滅)行為進(jìn)行了研究,進(jìn)而對(duì)機(jī)理進(jìn)行了探討。研究結(jié)果表明

6、,O2、H2O2及其氧化還原過(guò)程中生成的具有更強(qiáng)氧化性的活性氧(Reactiveoxygen species,ROSs)對(duì)魯米諾的電化學(xué)發(fā)光具有顯著的增敏效果,促進(jìn)魯米諾中間態(tài)自由基激發(fā),導(dǎo)致ECL,信號(hào)增強(qiáng),在生物反應(yīng)適合的酸度范同內(nèi),對(duì)魯米諾ECL的增敏作用尤其顯著,為研究生物ECL傳感器奠定了良好的基礎(chǔ)。由于辣根過(guò)氧化氫酶(HRP)催化H2O2的分解,故猝滅H2O2增敏的魯米諾ECL。其他酶催化反應(yīng)均可在電極表面產(chǎn)生活性氧物質(zhì),從

7、而增敏魯米諾的ECL,并可建立與相關(guān)底物濃度間的定量關(guān)系。研究中,結(jié)合循環(huán)伏安(Cyclic Voltammetry,CV)法,紫外-可見(jiàn)吸收光譜(Ultraviolet-Visible Absorption Spectrometry,UV-Vis)法等方法探討了有關(guān)機(jī)理。在此基礎(chǔ)上,采用能較好保持生物分子活性的固定化方法和材料,將生物活性物質(zhì)修飾于電極表面,制備了響應(yīng)性能優(yōu)良的ECL生物傳感器,穩(wěn)定性好,靈敏度高。將制備的ECL生物傳

8、感器應(yīng)用到一些生物分子(如超氧化物歧化酶、ALT、尿酸等)的檢測(cè)中,均獲得滿意的結(jié)果。這些ECL生物傳感器在保持生物分子活性的前提下,兼具了ECL的高靈敏度以及酶的高選擇性,對(duì)于相關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)的靈敏度高、檢測(cè)限低、具有很強(qiáng)的實(shí)用性。
　　 ⑶DNA是生物體的基本遺傳物質(zhì),是遺傳信息的載體,它在生物的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖等生命活動(dòng)中起著非常重要的作用。建立簡(jiǎn)單、敏感、特異和快速的病源、基因和藥物檢測(cè)方法,對(duì)疾病的預(yù)防、診斷和治療具有重

9、要的意義。研究了DNA在弱堿性介質(zhì)中對(duì)魯米諾ECL的猝滅作用,并用循環(huán)伏安法、紫外-可見(jiàn)吸收光譜法和熒光光譜法等討論了其猝滅機(jī)理。采用金納米粒子(Au NPs)和碳納米管(CNTs)的復(fù)合納米材料作為DNA的固定載體,應(yīng)用魯米諾的ECL作為對(duì)DNA響應(yīng)的信號(hào)輸出,制備了一種檢測(cè)限低,靈敏度高、重現(xiàn)性好的DNA生物傳感器。對(duì)應(yīng)用ECL技術(shù)于不同互補(bǔ)狀態(tài)的寡聚核苷酸雜交的表征進(jìn)行了研究,結(jié)果表明ECL技術(shù)可以作為一種可靠的免標(biāo)記表征雜交狀態(tài)

10、的手段。而藥物與DNA相互作用的研究是認(rèn)識(shí)某些疾病的致病機(jī)制和藥物的治療機(jī)制的基礎(chǔ),在闡明DNA結(jié)構(gòu)和功能方面也具有重要意義。研究中探討了利用ECL信號(hào)研究藥物小分子如氯霉素(CAP)對(duì)DNA的損傷行為,并對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行了探討,為藥物小分子損傷DNA的研究提供了一種可靠靈敏的檢測(cè)模型。該研究對(duì)開(kāi)發(fā)具有新穎特性的電化學(xué)發(fā)光探針和傳感界面構(gòu)造的新原理和新方法、以及設(shè)計(jì)和研制適用于檢測(cè)蛋白質(zhì)、基因或小分子藥物的高靈敏度、高選擇性、可重復(fù)使用