基于魯米諾及其功能化納米材料的新型電化學(xué)發(fā)光傳感器研究.pdf

1、電化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)（Electrochemiluminescence,ECL）是在化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的分析方法，它是通過電驅(qū)動促使某些物質(zhì)發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)形成激發(fā)態(tài)并通過輻射光子返回基態(tài)，并對發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行測量的一種分析方法。電化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)兼具了化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)技術(shù)的一些特點，比如靈敏度高、選擇性好、背景信號低、線性范圍寬，儀器設(shè)備簡單、易操控。其中以魯米諾為發(fā)光試劑的電化學(xué)發(fā)光傳感器在生物分子的檢測中表現(xiàn)出巨大的優(yōu)

2、越性，魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度可以被過氧化氫（H2O2）強(qiáng)烈增敏，在生命體系中，多種代謝中間產(chǎn)物在相應(yīng)氧化酶的催化下生成H2O2，據(jù)此建立起的基于酶-魯米諾體系的電發(fā)光傳感器可實現(xiàn)包括葡萄糖、乳酸、膽堿等在內(nèi)的多種活性物質(zhì)的靈敏檢測。隨著生命科學(xué)的快速發(fā)展，生物活性分子分析逐漸成為生物學(xué)家和分析家的的重要研究內(nèi)容，成為揭開生命奧秘、監(jiān)控生命體征、征服疾病的重要手段之一。因此，利用電化學(xué)發(fā)光開展對生物分子的定量分析已然成為研究的熱點。

3、>　　但是，電化學(xué)生物傳感器的蓬勃發(fā)展是近十年的時間，因此還具有巨大的上升空間?；隰斆字Z和酶構(gòu)建的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，其主要構(gòu)建模式目前還比較簡單，主要通過一些聚合膜對酶進(jìn)行簡單封裝，電阻高，酶活性中心受阻，因而其靈敏度也有待進(jìn)一步提高。同時，由于魯米諾分子是加入到待測溶液中，也會對樣品會產(chǎn)生一定的干擾和污染，對活體物質(zhì)可能有毒害作用，操作也相對復(fù)雜，因此所構(gòu)建的傳感器在使用壽命、穩(wěn)定性、長效性、靈敏度上均還有待提高。本研究即針對基

4、于魯米諾電致發(fā)光傳感器的重要性及存在的問題，借助納米科技的發(fā)展和應(yīng)用，致力于改善和提高魯米諾電發(fā)光傳感器的性能，一方面開發(fā)高效的響應(yīng)界面；另一方面以魯米諾為前驅(qū)體合成魯米諾功能化的電化學(xué)發(fā)光新材料，實現(xiàn)魯米諾的固定化制備固相電化學(xué)發(fā)光電極，從而對生物活性分子可以快速、靈敏、無污染的檢測。通過兩方面的改進(jìn)，為生物活性分子提供更有效的，充滿前途的分析方法。其主要研究內(nèi)容如下：
　　(1)基于三維響應(yīng)界面的葡萄糖電化學(xué)發(fā)光傳感器構(gòu)建及用

5、于葡萄糖的超靈敏檢測。葡萄糖是重要的生物活性分子，在近幾年中，采用ECL法構(gòu)建葡萄糖生物傳感器取得了一定進(jìn)展，但是在傳統(tǒng)的葡萄糖ECL傳感器的構(gòu)建當(dāng)中，葡萄糖氧化酶（GOD）主要通過nafion、殼聚糖等聚合膜封裝，電阻高，酶活性中心被封閉，因此靈敏度并不高。本工作將導(dǎo)電聚合物引入到葡萄糖ECL傳感器的構(gòu)建當(dāng)中，通過電聚合聚苯胺，在玻碳電極表面形成一層疏松、多孔的三維網(wǎng)狀聚苯胺納米線（PANi），然后制備帶負(fù)電荷的16nm的納米金顆粒，

6、并通過靜電作用吸附到表面富含氨基的聚苯胺納米線上，然后通過酶與納米金之間的靜電吸附及共價鍵合作用將GOD自組裝到納米金，最終構(gòu)建成三維的GOD/AuNPs/PANi響應(yīng)平臺。由于該結(jié)構(gòu)疏松多孔、導(dǎo)電性好、比表面積高，GOD負(fù)載量大，因此在以魯米諾為發(fā)光試劑進(jìn)行葡萄糖的ECL檢測時，表現(xiàn)出超靈敏的響應(yīng)，其線性范圍為0.1-100μM，檢測限0.05μM(S/N=3)。通過比較前人的工作，本實驗所設(shè)計的電化學(xué)發(fā)光傳感器具有更寬的線性范圍和更

7、低的檢測限。在對血清樣品中的葡萄糖進(jìn)行檢測時，也表現(xiàn)出良好的選擇性、穩(wěn)定性和靈敏度。
　?。?）新型電化學(xué)發(fā)光材料魯米諾還原納米金/還原氧化石墨烯復(fù)合物的合成及用于細(xì)胞釋放H2O2的檢測。在傳統(tǒng)的魯米諾電化學(xué)發(fā)光傳感器構(gòu)建當(dāng)中，魯米諾作為發(fā)光試劑是加入到待測溶液中，模式雖然簡單，但是魯米諾會對樣品、電極帶來一定的污染和干擾，對活體待測物可能有毒害，同時也會增加操作步驟，增大誤差。因此實現(xiàn)魯米諾在電極上的固定，進(jìn)行無試劑的檢測，是該

8、類傳感器構(gòu)建的重要發(fā)展目標(biāo)。石墨烯具有眾多非比尋常的物理、化學(xué)、光學(xué)性質(zhì)，在本實驗中，我們采用魯米諾還原氯金酸的辦法，在水熱條件下制備出魯米諾修飾的納米金粒子，并在制備的過程中，以片狀的還原氧化石墨烯為載體，一步合成出具有優(yōu)秀電化學(xué)發(fā)光特性的魯米諾還原納米金/還原氧化石墨烯復(fù)合物（Lu-AuNPs/rGO），用以制備性能優(yōu)良的固相電化學(xué)發(fā)光傳感器。過氧化氫（H2O2）是細(xì)胞中重要的生物活性小分子之一，對其進(jìn)行活細(xì)胞的實時檢測具有非常重要

9、的意義。我們進(jìn)一步利用合成的新材料、二甲基硅氧烷以及氧化銦錫玻璃構(gòu)建出即可用于直接培養(yǎng)細(xì)胞，又能夠進(jìn)行原位檢測細(xì)胞釋放H2O2的電化學(xué)發(fā)光傳感器，實現(xiàn)了對人肝癌細(xì)胞HepG2所釋放的H2O2的定量檢測。由于細(xì)胞與電極響應(yīng)界面的直接接觸以及電化學(xué)發(fā)光自身的高靈敏響應(yīng)特性，該傳感器對細(xì)胞釋放H2O2的檢測取得良好效果，而且發(fā)光試劑的固定也避免了魯米諾分子在溶液中對細(xì)胞的影響。
　　（3）爆米花狀聚魯米諾包裹納米金復(fù)合物的可控合成及用于

10、尿酸的固相電化學(xué)發(fā)光檢測。雖然魯米諾分子固定化前人做了一定的工作，包括本人合成高效的Lu-AuNPs/rGO材料，但是這些材料在長效性和穩(wěn)定性上還有待提高，因為從本質(zhì)上這些方法均是魯米諾分子在納米材料上的吸附，魯米諾分子有限導(dǎo)致在使用幾次后信號發(fā)生衰減。因此尋找發(fā)光更持久、穩(wěn)定的魯米諾納米材料非常具有吸引力，聚魯米諾是有效的選擇之一。在本實驗中，我們采用水熱法，通過調(diào)節(jié)魯米諾與氯金酸的反應(yīng)比例，合成出聚魯米諾包裹納米金的核殼結(jié)構(gòu)納米復(fù)合

11、材料（Au@Polyluminol），該復(fù)合物呈爆米花狀，形狀均一，分散度好，直徑在200nm左右。由于聚魯米諾聚合了大量的魯米諾分子，因此比魯米諾吸附的材料具有更穩(wěn)定和持久的發(fā)光性能，而且由于納米金增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光的作用，該材料對H2O2表現(xiàn)出高靈敏的ECL響應(yīng)。我們將該材料與尿酸酶結(jié)合制備用于尿酸檢測的固相電化學(xué)發(fā)光傳感器，結(jié)果對尿酸檢測表現(xiàn)出良好的線性范圍、檢測限、穩(wěn)定性以及選擇性?？梢灶A(yù)見該復(fù)合物作為一種新的電化學(xué)發(fā)光材料在構(gòu)建其

12、他ECL傳感器方面也將會發(fā)揮巨大作用。
　?。?）紅毛丹果狀葡萄糖氧化酶/聚魯米諾/納米金復(fù)合物的合成及用于葡萄糖檢測。在以聚魯米諾包裹納米金為電化學(xué)發(fā)光材料構(gòu)建酶生物傳感器的過程中，酶與材料之間的比例需要優(yōu)化和調(diào)節(jié)，增加了傳感器制備的過程，也加大了檢測誤差，如果能夠制備出即含有活性酶，又具有電化學(xué)發(fā)光性能的雙功能材料，那么將能夠直接實現(xiàn)各種生物分子的檢測，簡化傳感器制作步驟，增加檢測的穩(wěn)定性和重復(fù)性，具有非常大的應(yīng)用價值。在本實

13、驗中，我們發(fā)現(xiàn)即使在常溫下，只要有足夠的時間，氯金酸也可緩慢氧化魯米諾形成聚魯米諾包裹的納米金粒子。當(dāng)加入適量的葡萄糖氧化酶后，不但沒有阻止氧化的進(jìn)行，反而在酶的調(diào)節(jié)下生成紅毛丹果狀、形狀均一、分散度好、直徑400nm左右的納米絨球聚合物，經(jīng)成分分析其組成為葡萄糖氧化酶/聚魯米諾/納米金（Au/PLUM/GOD）。由于在常溫下合成，酶仍然保持其活性，基于該復(fù)合物構(gòu)建的生物傳感器后對葡萄糖表現(xiàn)出顯著的電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)，并具有較好的靈敏度和很