發(fā)卡式DNA電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的研究.pdf

1、基因結(jié)構(gòu)與基因功能研究的不斷深入已迅速推動(dòng)了人類(lèi)疾病的DNA診斷及基因治療的研究?；駾NA分子序列的微小改變，基因突變及多態(tài)性如一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代、缺失或增多，就會(huì)導(dǎo)致遺傳性狀的改變或各種疾病的出現(xiàn)。分子信標(biāo)是一種由寡聚核酸形成的發(fā)夾型分子，它包括一個(gè)環(huán)(loop)-干(stem)結(jié)構(gòu)。這種DNA探針有很高的雜交特異性。分子信標(biāo)因具有靈敏度高，特異結(jié)合性好等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和生物分析領(lǐng)域。在注重功能基因研究的后基因組時(shí)期，

2、分子信標(biāo)將會(huì)被更多地應(yīng)用于基因突變引起的疾病的研究、活細(xì)胞中：DNA的檢測(cè)、蛋白質(zhì)的檢測(cè)及生物芯片研究等。大規(guī)模的基因檢測(cè)要求建立更簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)、微型化的分析裝置。許多新的生物技術(shù)的開(kāi)發(fā)，為發(fā)展高靈敏度、高特異性的基因分析檢測(cè)方法注入了活力，其中利用DNA雙鏈的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則發(fā)展起來(lái)的各種DNA生物傳感技術(shù)，受到生物分析工作者的高度重視。 電化學(xué)發(fā)光是在電極上施加一定的電壓使電極反應(yīng)產(chǎn)物之間或電極反應(yīng)產(chǎn)物與溶液中某組分之間

3、進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生的一種光輻射。根據(jù)電化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度進(jìn)行的分析方法稱為電化學(xué)發(fā)光分析法。該方法具有化學(xué)發(fā)光法的靈敏度高、線性范圍寬和儀器簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，也具有電化學(xué)法容易控制等優(yōu)點(diǎn)。電化學(xué)發(fā)光DNA生物傳感器因其靈敏度高起而使其研究受到人們的關(guān)注。但是，現(xiàn)報(bào)道電化學(xué)發(fā)光：DNA生物傳感器存在背景信號(hào)大或目標(biāo)物需要修飾等缺點(diǎn)。 本論文的目的是探索研究以發(fā)卡式DNA為分子識(shí)別物質(zhì)，以釕聯(lián)吡啶衍生物為電化學(xué)發(fā)光信號(hào)物質(zhì)，構(gòu)建高選擇性簡(jiǎn)單的

4、電化學(xué)發(fā)光DNA生物傳感器的可行性，研究發(fā)卡式DNA探針的結(jié)構(gòu)對(duì)傳感器選擇性的影響。 本論文由緒論、研究報(bào)告兩部分組成。第一部分為緒論，介紹了DNA傳感器原理、分類(lèi)，總結(jié)了電化學(xué)發(fā)光分析體系和分析方法特點(diǎn)，分子信標(biāo)的特性，綜述了DNA檢測(cè)方法的研究進(jìn)展和應(yīng)用，最后闡述了本論文的研究目的和內(nèi)容。第二部分為研究報(bào)告，由兩部分組成。研究報(bào)告的第一部分為發(fā)卡式DNA電化學(xué)發(fā)光生物傳感器制作和基本性能的研究。提出用二(2，2’-聯(lián)吡啶)(

5、2，2’-吡啶-4,4’-二碳酸)琥珀酰胺釕(Ru(bpy)<,2>(dcbpy)NHS)標(biāo)記發(fā)卡式DNA，制得探針 Ru(boy)<,2>(dcbpy)NHS-hairpin-DNA，將探針固定在金電極上制得電化學(xué)發(fā)光傳感器，與待測(cè)的目標(biāo)DNA雜交，然后在含有三丙胺(TPA)的雜交緩沖溶液中施加電壓，記錄電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，通過(guò)電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的變化對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行檢測(cè)。 當(dāng)不存在互補(bǔ)ss-DNA時(shí)，探針處于閉合狀態(tài)，標(biāo)記物釕聯(lián)吡啶

6、離電極很近，產(chǎn)生強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)；存在互補(bǔ)序列時(shí)，探針與目標(biāo)ss-DNA發(fā)生雜交發(fā)應(yīng)，環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，形成剛性的直鏈ds-DNA，標(biāo)記物遠(yuǎn)離電極，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度降低。試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)卡式DNA為探針與傳統(tǒng)的直鏈DNA探針檢測(cè)相比，可以極大的提高電化學(xué)發(fā)光傳感器的選擇性；電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與目標(biāo)DNA濃度的負(fù)對(duì)數(shù)在2.7×10<'-10>mol L<'-1>～5.4×10<'-6> mol L<'-1>范圍內(nèi)分段成線形關(guān)系，檢出限為9.0×

7、10<'-11>mol L<'-1>，對(duì)1.0×10<'-9>mol L<'-1>濃度的靶DNA進(jìn)行7次測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.9％。研究報(bào)告的第二部分研究了不同發(fā)卡式DNA電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的選擇性問(wèn)題。研究了電化學(xué)發(fā)光傳感器對(duì)單堿基錯(cuò)配序列以及多堿基錯(cuò)配序列的識(shí)別，發(fā)現(xiàn)本文設(shè)計(jì)的傳感器能夠?qū)螇A基錯(cuò)配序列從互補(bǔ)序列中區(qū)分開(kāi)來(lái)。還研究了固定有不同環(huán)長(zhǎng)探針傳感器的選擇性，將不同長(zhǎng)度發(fā)卡式DNA的探針固定于金電極上，與待測(cè)目標(biāo)進(jìn)行雜交后

8、，將雜交后的電極作為工作電極，在含有TPA的溶液中進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光測(cè)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，探針中DNA的長(zhǎng)度影響其在電極表面的固定量，且制作的傳感器可以很好的檢測(cè)多堿基錯(cuò)配系列。選擇合適的發(fā)卡式DNA，提高傳感器的選擇性。 本研究工作主要以電化學(xué)發(fā)光為檢測(cè)手段，結(jié)合發(fā)卡式DNA、DNA雜交技術(shù)、自組裝技術(shù)制作了一種新的電化學(xué)發(fā)光DNA傳感器。本論文的研究結(jié)果表明，以發(fā)卡式DNA為分子識(shí)別物質(zhì)，以釕聯(lián)吡啶衍生物為電化學(xué)發(fā)光信號(hào)物質(zhì)，構(gòu)建