DNA電化學(xué)生物傳感器的設(shè)計.pdf

1、隨著人類基因組計劃(HGP)的實施，基因診斷已經(jīng)成為分子生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中的重要領(lǐng)域。人體、病毒和細菌核酸中特定堿基序列的檢測在疾病診斷、食品污染、法醫(yī)鑒定和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域都將會發(fā)揮越來越重要的作用。大規(guī)模的基因檢測要求建立更簡便、迅速、廉價、微型化的分析裝置。許多新的生物技術(shù)的開發(fā)，為發(fā)展高靈敏度、高特異性的基因分析檢測方法注入了活力，其中利用DNA雙鏈的堿基互補配對原則發(fā)展起來的各種DNA生物傳感技術(shù)，受到生物分析工作者的高度重

2、視。電化學(xué)DNA生物傳感器以其靈敏度高、輕巧便宜、攜帶方便、耗能少、能與現(xiàn)代微電子技術(shù)聯(lián)用，易于實現(xiàn)微型化等優(yōu)點，受到了研究者們的廣泛關(guān)注，儼然成為當今生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的前沿性課題。 法拉第交流阻抗技術(shù)是研究電極過程的有效工具，被廣泛的應(yīng)用于電化學(xué)研究領(lǐng)域，可以得到比其他電化學(xué)方法更多的動力學(xué)信息及電極界面結(jié)構(gòu)的信息，例如，電子傳遞電阻、雙電層電容等。用該技術(shù)構(gòu)建的電化學(xué)DNA生物傳感器，可以檢測雜交前后電極表面電化學(xué)性質(zhì)的變化

3、，具有靈敏、迅速、非標記的優(yōu)點。 近兩年，隨著人類基因組計劃的完成和功能基因?qū)W、蛋白組學(xué)研究的開展，發(fā)展能對重要蛋白質(zhì)進行實時檢測跟蹤的高靈敏度的分析方法是后基因組時期一個重要的研究領(lǐng)域。傳統(tǒng)蛋白質(zhì)的檢測主要利用抗體-抗原的特異相互作用。核酸識體對蛋白質(zhì)的結(jié)合力和特異性可與蛋白質(zhì)的抗原抗體間的作用力相媲美，且比抗體有許多優(yōu)越性。例如：核酸識體是人工化學(xué)合成，合成簡單、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好，而且可以按需要對序列中的核苷酸定點修飾各種官

4、能團(如熒光基團等)，便于核酸識體的固定化和信號的檢測，與蛋白質(zhì)作用的動力學(xué)參數(shù)可以按要求改變等。因此人們利用核酸適體構(gòu)建蛋白質(zhì)生物傳感器已引起許多科學(xué)工作者的關(guān)注。 本論文有機結(jié)合了核酸分子的堿基互補配對原則、法拉第交流阻抗技術(shù)以及核酸適體對蛋白質(zhì)的特異性識別能力，設(shè)計了幾種新型的電化學(xué)DNA生物傳感器，不僅能快速、靈敏和準確的檢測特定序列的DNA片段，還能識別對應(yīng)的蛋白質(zhì)分子，拓寬了后基因時代的研究領(lǐng)域 論文分為五章

5、：第一章：緒論首先系統(tǒng)介紹了DNA生物傳感器的基本結(jié)構(gòu)和分類。著重介紹了DNA電化學(xué)生物傳感器的設(shè)計，如DNA片段的固定方法、DNA雜交及雜交信號的轉(zhuǎn)化兩方面。接著介紹了交流阻抗技術(shù)的基本原理，及在DNA生物傳感器方面的應(yīng)用和研究進展。最后介紹了核酸適體的概念及應(yīng)用、研究現(xiàn)狀。 第二章：基于硫堇—碳納米管修飾電極的電化學(xué)DNA生物傳感器本章介紹了一種基于硫堇-碳納米管修飾的玻碳電極構(gòu)建的DNA生物傳感器，檢測痕量的目標DNA。利

6、用硫堇(TH)和羧基化的多壁碳納米管之間的π-π堆積作用將硫堇連接到碳納米管上，固定、雜交。然后用差分脈沖伏安法(DPV)檢測道諾酶素和修飾電極表面的雙鏈DNA(dsDNA)發(fā)生相互作用時所產(chǎn)生的電信號。電極表面修飾的硫堇-碳納米管，一方面可以顯著增加DNA的固定量，另一方面可以增強電極表面的電子傳遞能力。因此該硫堇-碳納米管修飾電極相比于其它電極可以獲得更低的檢測限，達到3.0×10-13M。 第三章基于交流阻抗技術(shù)構(gòu)建的DN

7、A生物傳感器本章設(shè)計了一種基于交流阻抗技術(shù)構(gòu)建的DNA生物傳感器直接監(jiān)測DNA雜交的方法。將5’端巰基修飾的24個堿基的寡聚核苷酸DNA(SH-ssDNA)和巰基乙酸(SH-CH2COOH)同時自組裝到金電極表面，形成雜交識別層，用循環(huán)伏安法和法拉第交流阻抗技術(shù)進行監(jiān)測，取雜交前后信號的改變值作為雜交信號。實驗中優(yōu)化了各項條件，如雜交識別層的固定時間、雜交識別層中SH-ssDNA和SH-CH2COOH的比例、雜交溫度和時間等。在優(yōu)化的實

8、驗條件下，此DNA生物傳感器能達得到3.0×10-14M的檢測下限；單堿基錯配和三堿基錯配的信號值分別為完全互補序列的55.6％和1.3％。 第四章基于硫堇電荷中和作用的電化學(xué)阻抗DNA雜交傳感器本章介紹了一種運用硫堇電荷中和作用構(gòu)建的交流阻抗DNA雜交傳感器。將5’端修飾有巰基的單鏈發(fā)卡DNA探針與巰基乙酸同時自組裝到金電極表面，形成DNA分子識別層。然后將硫堇分子嵌入到雜交后的雙鏈DNA分子中，利用硫堇對雙鏈DNA的電荷中和

9、作用使修飾電極的表面電子傳遞電阻(Ret)減小。實驗中選擇發(fā)卡DNA探針修飾電極和硫堇嵌入后的雙鏈DNA修飾電極的Ret差值作為雜交信號，以基于發(fā)卡DNA探針的特殊結(jié)構(gòu)和硫堇的嵌入法擴增雜交信號，該DNA雜交傳感器具有較好的檢測靈敏度和選擇性。在雜交溫度優(yōu)化條件下，此DNA傳感器的對完全互補鏈的檢測下限為5.0×10-13M，一個堿基錯配序列的雜交信號是完全互補序列信號的38.9％。 第五章基于交流阻抗技術(shù)和DNA適體構(gòu)建的蛋白