DNA電化學(xué)生物傳感器中的新方法學(xué)研究.pdf

1、隨著疾病診斷、基因測(cè)試、法醫(yī)鑒證、生化戰(zhàn)爭預(yù)防、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域的發(fā)展，對(duì)特定DNA序列進(jìn)行準(zhǔn)確、簡單、快速的檢測(cè)越顯重要。DNA生物傳感器主要是利用堿基互補(bǔ)原理對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)已知序列DNA探針與被檢的DNA序列發(fā)生雜交反應(yīng)，來辨明DNA的存在與否。其中，電化學(xué)DNA生物傳感器利用雜交原理及電化學(xué)標(biāo)記物為雜交檢測(cè)信號(hào)，具有操作簡便快速、信號(hào)靈敏，能與DNA生物芯片兼容等優(yōu)點(diǎn)，具有非常重要的研究價(jià)值。目前電化學(xué)DNA檢測(cè)方法以其輕

2、巧便宜、高靈敏度、方便攜帶、能耗少、易于實(shí)現(xiàn)微型化等優(yōu)點(diǎn)，受到了廣泛的關(guān)注，成為當(dāng)今生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的前沿性課題。納米技術(shù)的出現(xiàn)為各個(gè)科學(xué)領(lǐng)域提供新的發(fā)展前景。納米微粒具有的特點(diǎn)有：大比表面積、高活性、高特異物性、極微小性等，與傳感器所要求的多功能、微型化相互匹配。作為理想的傳感器材料，需要有著高靈敏度、多樣功能性、響應(yīng)高，速度快、檢測(cè)范圍寬、選擇性高、穩(wěn)定性好。納米微粒能很好地滿足上述要求。以納米材料為原料的化學(xué)傳感器能夠應(yīng)用于生產(chǎn)、

3、生活、環(huán)境監(jiān)測(cè)等各個(gè)領(lǐng)域；目前單分子水平的探針制備技術(shù)、納米集成陣列電極、修飾電極等方面的研究取得巨大的進(jìn)展。超分子化學(xué)是分子之間通過非共價(jià)鍵相互作用而形成的分子聚集體的化學(xué)學(xué)科，隨著與醫(yī)藥科學(xué)、生命生物科學(xué)、信息科學(xué)、納米材料科學(xué)的交叉融合中，超分子化學(xué)已發(fā)展為應(yīng)用范圍廣泛的超分子科學(xué)。被認(rèn)為是21世紀(jì)新思路和高科技的重要基礎(chǔ)學(xué)科之一。環(huán)糊精作為典型的超分子識(shí)別個(gè)體中的重要主體化合物以其獨(dú)特的識(shí)別性質(zhì)受到廣泛的關(guān)注。對(duì)它的研究從主客體

4、識(shí)別形成包合物的機(jī)理已經(jīng)轉(zhuǎn)移到對(duì)其在分析化學(xué)、醫(yī)藥制備、環(huán)境檢測(cè)和生物傳感器等領(lǐng)域的應(yīng)用研究。本文的主要?jiǎng)?chuàng)新之處就是將納米技術(shù)及超分子包合作用相互融合構(gòu)建了不需要固定探針的新型DNA電化學(xué)生物傳感器。同時(shí)基于生物分子之間的替代作用等與電化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建了用于檢測(cè)DNA及凝血酶蛋白的電化學(xué)傳感器。這兩種傳感器具有高特異性，及構(gòu)建簡單，能夠成功地應(yīng)用于對(duì)特定序列DNA片斷的選擇性測(cè)定和對(duì)目標(biāo)蛋白的準(zhǔn)確識(shí)別，為基因及蛋白質(zhì)分析測(cè)定提供了

5、一種簡便、便捷、廉價(jià)的新理念。本研究分為六個(gè)部分：
　　 第一章緒論。介紹了DNA電化學(xué)生物傳感器的研究進(jìn)展。著重介紹了DNA生物傳感器的原理（包括DNA探針及其分子識(shí)別原理和探針DNA在固體基質(zhì)表面的固定化）和DNA生物傳感器中不同的雜交電化學(xué)標(biāo)示劑，敘述了DNA電化學(xué)傳感器在基因檢測(cè)等方面的應(yīng)用。接著介紹了核酸適配體生物傳感器和碳納米管在生物傳感器中的一系列應(yīng)用。最后闡述了本論文的目的和意義，指出論文的創(chuàng)新之處及主要研究內(nèi)容

6、。
　　 第二章基于蛋白與其核酸適配體的替代機(jī)理構(gòu)建的凝血酶電化學(xué)生物傳感器的研究?；谀繕?biāo)蛋白與其核酸適配體替代機(jī)制構(gòu)建的設(shè)計(jì)了一種電化學(xué)適體傳感器。該傳感器預(yù)先將含有巰基的單鏈固定DNA(IP)與目標(biāo)凝血酶(thrombin)核酸適配體(aptamer)通過雜交反應(yīng)得到雙鏈DNA(dsDNA)，通過Au-S鍵自組裝于金電極表面，而另一標(biāo)記有CdS納米顆粒的單鏈DNA(DP-CdS)被用作檢測(cè)探針。當(dāng)預(yù)先制備好的雙鏈DNA修飾

7、金電極浸入含有凝血酶與DP-CdS的共存的溶液時(shí)，dsDNA中的aptamer更傾向與目標(biāo)thrombin結(jié)合形成G-四分體，從而引起dsDNA離解，IP從而能夠與DP-CdS堿基互補(bǔ)。將電極捕獲的CdS納米顆粒溶解，使用汞膜電極對(duì)溶出的Cd2+離子進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，獲得靈敏的電化學(xué)信號(hào)傳遞。Cd2+離子的峰電流相對(duì)thrombin濃度在2.3×10-9-2.3×10-12mol/L范圍內(nèi)有良好的線性響應(yīng)，檢出限為4.3×10-13mol

8、/L。檢測(cè)具有良好的特異性，BSA，溶菌酶等其他蛋白質(zhì)共存不會(huì)影響thrombin的檢測(cè)。
　　 第三章基于DNA競(jìng)爭替代機(jī)理的電化學(xué)開關(guān)生物傳感器的研究。設(shè)計(jì)了一種基于DNA之間雜交競(jìng)爭替代機(jī)制的電化學(xué)DNA傳感器。該傳感器通過預(yù)先將3’修飾了巰基，5’修飾了二茂鐵的發(fā)夾探針DNA與識(shí)別DNA雜交形成雙鏈DNA，然后通過金硫鍵將其組裝于金電極表面。此時(shí)二茂鐵位于雙鏈DNA的頂端，遠(yuǎn)離電極表面，呈現(xiàn)出“Switch-off”狀態(tài)

9、，僅僅產(chǎn)生一個(gè)小的背景信號(hào)。目標(biāo)DNA加入后，由于與識(shí)別DNA之間具有更多互補(bǔ)堿基，在雜交的競(jìng)爭作用下，識(shí)別DNA離開探針DNA，與目標(biāo)結(jié)合，探針DNA隨之恢復(fù)原有的發(fā)夾狀態(tài)，二茂鐵靠近電極表面，呈現(xiàn)出“Switch-on”狀態(tài)，同時(shí)獲得一個(gè)較大的電化學(xué)信號(hào)。通過目標(biāo)加入前后電化學(xué)信號(hào)變化，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)的檢測(cè)。本文將適體技術(shù)、電化學(xué)分子信標(biāo)技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)DNA和蛋白質(zhì)的靈敏、高效、方便的檢測(cè)。此電化學(xué)競(jìng)爭開關(guān)生物傳感器有望在生

10、物檢測(cè)領(lǐng)域有更廣泛的應(yīng)用。
　　 第四章基于β-環(huán)糊精主客體識(shí)別和CdS納米顆粒構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器?；谥骺腕w分子識(shí)別技術(shù)設(shè)計(jì)了一種不需要固定探針DNA的電化學(xué)檢測(cè)DNA的新方法。這種傳感技術(shù)采用了一種新穎的以莖環(huán)結(jié)構(gòu)形式存在的雙標(biāo)記DNA探針(DLP)，該探針的一端標(biāo)記了4-4-二甲氨基苯基偶氮苯甲酸(dabcyl)作為客體分子，另一端連接了CdS納米顆粒作為電化學(xué)指示劑指示雜交反應(yīng)的發(fā)生。同時(shí)使用環(huán)糊精修飾的電極捕獲DL

11、P上標(biāo)記的dabcyl。雜交反應(yīng)發(fā)生前，探針保持莖環(huán)結(jié)構(gòu)，迫使dabcyl分子靠近CdS納米顆粒。由于空間立體效應(yīng)，阻礙了dabcyl與電極表面β-CD的結(jié)合，導(dǎo)致DLP不能被電極捕獲。與目標(biāo)DNA雜交后，DLP的莖環(huán)結(jié)構(gòu)展開，使得dabcyl分子易于進(jìn)入修飾電極表面的β-CD空腔中，進(jìn)而DLP信號(hào)可以被β-CD修飾電極捕獲。并且，捕獲效應(yīng)與目標(biāo)DNA濃度成正比。
　　 第五章基于主客體識(shí)別作用構(gòu)建的非固定的DNA電化學(xué)生物傳感

12、器的研究?；谥骺腕w分子識(shí)別技術(shù)構(gòu)建了電化學(xué)檢測(cè)DNA的新方法。這種傳感技術(shù)采用了一種新穎的以莖環(huán)結(jié)構(gòu)形式存在的雙標(biāo)記DNA探針(DLP)，該探針的一端標(biāo)記了4-4-二甲氨基苯基偶氮苯甲酸(dabcyl)作為客體分子，另一端標(biāo)記了金膠作為電化學(xué)指示劑指示雜交反應(yīng)的發(fā)生。同時(shí)采用α-CD/MCNTs/GCE電極捕獲雜交反應(yīng)轉(zhuǎn)換產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào)。雜交反應(yīng)發(fā)生前，雙標(biāo)記DNA探針保持莖環(huán)結(jié)構(gòu)，迫使dabcyl分子靠近金膠。由于金膠的空間立體效

13、應(yīng)，阻礙了dabcyl與電極表面α-CD的結(jié)合，導(dǎo)致DLP不能被電極捕獲。與目標(biāo)DNA雜交后，DLP的莖環(huán)結(jié)構(gòu)展開，使得dabcyl分子易于進(jìn)入修飾電極表面的α-CD空腔中，進(jìn)而DLP信號(hào)可以被α-CD修飾電極捕獲。并且，捕獲效應(yīng)與目標(biāo)DNA濃度成正比。因此，與目標(biāo)的雜交過程可靈敏地轉(zhuǎn)換并檢測(cè)DLP標(biāo)記的金膠AuCl4-的電化學(xué)還原電流信號(hào)。采用這種新方法，檢測(cè)目標(biāo)DNA的濃度可低至2.6×10-10M甚至對(duì)單堿基錯(cuò)配也有很好的區(qū)分能力

14、。
　　 第六章基于環(huán)糊精修飾的納米顆粒構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器的研究。構(gòu)建了一種基于環(huán)糊精修飾的納米顆粒的電化學(xué)DNA傳感器，將DNA雜交引起的探針DNA構(gòu)型變化通過主客體識(shí)別技術(shù)與納米顆粒標(biāo)記結(jié)合，并轉(zhuǎn)換為電化學(xué)信號(hào)。該傳感器中，末端標(biāo)記有4-4-二甲氨基苯基偶氮苯甲酸(dabcyl)和巰基基團(tuán)的發(fā)夾DNA作為探針DNA通過金硫鍵組裝于金電極表面，而表面修飾有β-環(huán)糊精的CdS納米顆粒(CdS-CDs)則被用于電化學(xué)信號(hào)提供者