基于核酸的生物傳感器在電化學(xué)、熒光和電致化學(xué)發(fā)光的研究.pdf

1、DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的檢測(cè)一直備受關(guān)注，在疾病診斷、基因治療、醫(yī)療預(yù)防以及環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面具有重要意義。近幾十年來(lái)，核酸在生物傳感器上的應(yīng)用主要包括2大類，一是檢測(cè)DNA/RNA的傳感器，二是利用核酸適配體構(gòu)建的生物傳感器。本論文的研究工作，以核酸為核心，以電化學(xué)、熒光和電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)為手段，設(shè)計(jì)了分析檢測(cè)DNA、microRNA和凝血酶因子的生物傳感器，主要研究?jī)?nèi)容包括:
　　第一章，緒論。介紹了核酸的基本知識(shí)，重點(diǎn)闡述了基

2、于核酸的生物傳感器在電化學(xué)、熒光和電致化學(xué)發(fā)光領(lǐng)域的研究進(jìn)展，以及酶信號(hào)放大的重要意義，闡明了本論文的選題依據(jù)和研究?jī)?nèi)容。
　　第二、三章，設(shè)計(jì)了兩種非標(biāo)記的變構(gòu)分子信標(biāo)(aMB)電化學(xué)傳感器來(lái)分別檢測(cè)呼吸道合胞病毒(RSV)的DNA和microRNAlet7a。這兩種aMB信標(biāo)自身的發(fā)夾結(jié)構(gòu)封閉了鏈霉親和素(SA)的核酸適配體序列，在結(jié)合目標(biāo)物序列后打開(kāi)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，激活SA的核酸適配體，用于結(jié)合SA修飾的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)到

3、電極表面產(chǎn)生電化學(xué)催化信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的分析檢測(cè)。這種傳感器將核酸適配體應(yīng)用到核酸傳感器設(shè)計(jì)中，取代了利用抗原抗體來(lái)連接核酸和蛋白質(zhì)的方法。實(shí)驗(yàn)考察了DNA修飾電極在TMB溶液中的氧化還原性質(zhì)，利用循環(huán)伏安法觀測(cè)到TMB氧化產(chǎn)物在DNA上的吸附現(xiàn)象。傳感器對(duì)目標(biāo)物顯示出良好的選擇性響應(yīng)，對(duì)RSVDNA和microRNA的檢測(cè)限分別為11pmol/L和3.4pmol/L。
　　第四章，外切酶Ⅲ(ExoⅢ)被用來(lái)循環(huán)剪切DNA探

4、針以達(dá)到信號(hào)放大的目的。研究發(fā)現(xiàn)，ExoⅢ不僅能夠酶切dsDNA雙鏈，對(duì)ssDNA也有酶切性能，這使得目標(biāo)物DNA在信號(hào)放大的過(guò)程中受到酶切作用，導(dǎo)致信號(hào)循環(huán)放大效果降低。因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了雙重的ExoⅢ酶切放大法來(lái)分析檢測(cè)ssDNA，先讓探針P1與目標(biāo)物DNA結(jié)合后受到ExoⅢ的酶切作用而釋放出一條對(duì)ExoⅢ穩(wěn)定的DNA，使其參與第二重的酶切作用，讓酶切放大效果能夠持續(xù)較長(zhǎng)的時(shí)間，獲得更好的檢測(cè)靈敏度。實(shí)驗(yàn)利用PAGE電泳驗(yàn)證探針的設(shè)計(jì)

5、方案的可行性，并用熒光標(biāo)記P2進(jìn)一步分析tDNA，后續(xù)工作將繼續(xù)完善。這種DNA放大檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)了一個(gè)tDNA讓多個(gè)熒光分子發(fā)光的模式，極大降低了分析的檢測(cè)限，對(duì)于低濃度DNA的直接分析檢測(cè)具有重要意義。
　　第五章，設(shè)計(jì)了檢測(cè)凝血酶因子的核酸適配體電致化學(xué)發(fā)光(ECL)生物傳感器。核酸適配體的應(yīng)用大大提高了ECL傳感器的選擇性。在ECL傳感器的設(shè)計(jì)過(guò)程中，ECL染料的固定技術(shù)非常重要，實(shí)驗(yàn)嘗試了多種在電極表面修飾釕硅球的方法:N

6、ation聚合物固定釕硅球的方法，可用于冰毒的分析檢測(cè)，其穩(wěn)定性好但缺乏連接核酸的必要條件;殼聚糖修飾到玻碳電極表面作為載體進(jìn)一步連接釕硅球，雖然觀察到ECL信號(hào)，但是殼聚糖的導(dǎo)電性較差，ECL信號(hào)靈敏度較低;用對(duì)氨基苯甲酸來(lái)改性玻碳電極表面，然后共價(jià)連接上氨基化的釕硅球，能達(dá)到較好的ECL信號(hào)，但是信號(hào)不穩(wěn)定;利用CV方法直接將氨基化的釕硅球修飾到玻碳電極表面，獲得一個(gè)信號(hào)大小適中相對(duì)穩(wěn)定的ECL信號(hào)。最后凝血酶因子的核酸適配體被修飾