核酸探針電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器檢測(cè)土壤中鉛離子的研究.pdf

1、重金屬離子具有生物毒性大、易被生物富集、難于自然降解等的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害生態(tài)環(huán)境和人類生命健康，而傳統(tǒng)檢測(cè)方法多依賴大型儀器，存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，靈敏度相對(duì)較低等缺點(diǎn)，因此探索建立快速、靈敏、低成本的痕量重金屬分析檢測(cè)方法有重要意義。電致化學(xué)發(fā)光（ECL）結(jié)合了發(fā)光分析的高靈敏度和電化學(xué)分析的高可控性，具有重現(xiàn)性好、靈敏度高和選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，可顯著提高分析檢測(cè)靈敏度和選擇性，尤其適用于被測(cè)物濃度低，組分復(fù)雜，干擾物多的環(huán)境樣品。本文以土壤中P

2、b2+的檢測(cè)為研究模型，利用具有高選擇性的核酸探針為識(shí)別元件，從信號(hào)輸出模式、ECL體系、核酸放大技術(shù)等多方面著手，并進(jìn)一步結(jié)合多種復(fù)合納米材料，設(shè)計(jì)構(gòu)建了多種高靈敏ECL檢測(cè)Pb2+的新方法。研究結(jié)果為污染土壤 Pb2+的快速、靈敏的檢測(cè)提供了一個(gè)新的思路和方法，有利于提高Pb2+的檢測(cè)精度，在土壤、水環(huán)境分析實(shí)踐中具有十分重要的意義。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴結(jié)合目標(biāo)物循環(huán)與雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）信號(hào)放大策略構(gòu)建了Pb2+E

3、CL生物傳感器。該傳感器可以通過 Pb2+和脫氧核酶（LC）的特異識(shí)別作用，并結(jié)合目標(biāo)物循環(huán)和雜交鏈?zhǔn)剑℉CR）反應(yīng)，在電極表面生成了大量由DNA雜交形成的長(zhǎng)雙鏈聚合物。這些雙鏈聚合物可以通過靜電吸附作用固載ECL信號(hào)分子鄰菲羅啉釕配合物。利用固載在電極基底的聚乙烯亞胺還原的金納米顆粒對(duì)發(fā)光試劑的共反應(yīng)作用顯著放大檢測(cè)信號(hào)，構(gòu)建了對(duì)Pb2+的“signal on”響應(yīng)模式ECL檢測(cè)新方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在Pb2+濃度范圍為1×10-12

4、 mol/L~1×10-7 mol/L（2.07×10-10 g/L~2.07×10-5 g/L）之間，表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其檢出限為3.33×10-13 mol/L(6.89×10-11 g/L)。將該方法用于土壤樣品中鉛離子的檢測(cè)，所得回收率介于98.7%~103%之間，說明該傳感器對(duì)Pb2+的檢測(cè)良好的準(zhǔn)確度。⑵制備了多邊形的金納米顆粒（HIFAuNPs）作為固載基質(zhì)，聚酰胺-胺型樹枝狀高分子 PAMAM既作為交聯(lián)分子又作為共反

5、應(yīng)基團(tuán)，通過酰胺反應(yīng)將發(fā)光試劑羧基化聯(lián)吡啶釕 Ru-COOH與 PAMAM交聯(lián)到同一個(gè)分子內(nèi)，制備了具有更高發(fā)光效率的自增強(qiáng)的ECL發(fā)光試劑作為ECL信標(biāo)。另一方面，將 L-半胱氨酸（L-Cys）和金納米顆粒電沉積到電極上，增大了電極的比表面積，用以固定大量端基為巰基的輔助探針（APs），同時(shí)L-Cys與Ru-COOH通過分子間共反應(yīng)增強(qiáng)了ECL信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)了分子間和分子內(nèi)共反應(yīng)雙重信號(hào)放大策略。當(dāng)Pb2+存在時(shí)，Pb2+與固載到電極

6、界面的捕獲探針（Cps）形成了穩(wěn)定的G-四鏈體，誘導(dǎo)雙鏈DNA釋放CPs。電極上的APs進(jìn)一步捕獲信標(biāo)產(chǎn)生ECL信號(hào)，Pb2+濃度越大，ECL響應(yīng)越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法具有較好的選擇性和穩(wěn)定性，其線性范圍為1.0×10-13 mol/L~1.0×10-7 mol/L(2.07×10-11 g/L~2.07×10-5 g/L)，檢出限為3.33×10-14 mol/L(6.89×10-12 g/L)。用ECL適體傳感器和傳統(tǒng)的石墨爐原

7、子吸收光譜法（GF-AAS）對(duì)相同的土壤樣品進(jìn)行檢測(cè)，兩種方法之間具有較好的一致性，證明該傳感器在檢測(cè)環(huán)境土壤中痕量的Pb2+很有應(yīng)用潛力。⑶制備了分子內(nèi)自增強(qiáng)ECL分子PAMAM-Ru作為發(fā)光物質(zhì)直接標(biāo)記對(duì)鉛離子有特異識(shí)別作用的脫氧核酶8-17 DNAzyme的底物鏈。該分子通過分子內(nèi)的相互作用及快速電子傳遞，極大地提高了ECL試劑的發(fā)光效率及穩(wěn)定性。另一方面，制備了納米金功能化的石墨烯和C60的復(fù)合物（Au@rGO-C60），利用該

8、納米復(fù)合材料自身的大比表面積固載大量的8-17 DNAzyme使其與底物鏈結(jié)合形成Pb2+特異剪切位點(diǎn)，同時(shí)由于其自身具有促進(jìn)電子傳遞作用進(jìn)一步放大響應(yīng)信號(hào)。當(dāng)測(cè)試溶液中含有S2O82-作為分子間共反應(yīng)試劑時(shí)，與PAMAM分子內(nèi)自增強(qiáng)作用相結(jié)合實(shí)現(xiàn)雙重信號(hào)放大，獲得較強(qiáng)的初始信號(hào)。當(dāng) Pb2+存在時(shí)，識(shí)別特異的剪切位點(diǎn)，從而使結(jié)合到電極表面的PAMAM-Ru離開電極，ECL信號(hào)顯著降低，構(gòu)建了“signal off”型ECL鉛離子傳感器

9、。其檢測(cè)范圍為1.0×10-15 mol/L~1.0×10-8 mol/L(2.07×10-13 g/L~2.07×10-6 g/L)，檢測(cè)限為3.33×10-16 mol/L(6.89×10-14 g/L)。將制備的傳感器用于實(shí)際土壤樣品中Pb2+的檢測(cè)，并采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)傳感器回收率進(jìn)行了測(cè)定，所得回收率介于96.2%~103%之間，說明傳感器具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。⑷以C60作為新型碳源，利用強(qiáng)酸氧化法加熱回流合成法制得碳量子點(diǎn)（

10、CQDs）為ECL發(fā)光試劑，并通過交聯(lián)作用將CQDs固載到氨基功能化的石墨烯納米材料表面?；趬A基的互補(bǔ)配對(duì)原則在電極表面引入標(biāo)記了金納米粒子的鉛離子適體探針互補(bǔ)鏈（CDNA），以增強(qiáng)適體傳感器的ECL響應(yīng)，制得Pb2+適體傳感器。當(dāng)有目標(biāo)物 Pb2+存在時(shí)，Pb2+與其適體鏈形成 G四鏈體結(jié)構(gòu)，釋放出金納米粒子標(biāo)記的增強(qiáng)探針，從而使得 ECL信號(hào)減小。該傳感器的檢測(cè)范圍為1.0×10-13 mol/L~1.0×10-3 mol/L(2

11、.07×10-11 g/L~2.07×10-1 g/L)，檢測(cè)限為3.3×10-11 mol/L(6.89×10-12 g/L)。該ECL適體傳感器對(duì)實(shí)際土壤樣品中的Pb2+進(jìn)行檢測(cè)，其回收率在98.8-105%。⑸利用“signal on-off-on”型檢測(cè)模式構(gòu)建超靈敏 ECL鉛離子傳感器。首先利用金納米粒子的促進(jìn)電子傳遞作用得到S2O82-的超高信號(hào)作為初始“signal-on”信號(hào)。接著利用線性滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)得到一條與環(huán)形DNA

12、模板互補(bǔ)的具有大量G堿基的酶鏈序列，使之與氯化血紅素結(jié)合形成 hemin/G-四鏈體結(jié)構(gòu)，它的存在導(dǎo)致 S2O82-電致化學(xué)發(fā)光猝滅，得到較低 ECL信號(hào)的“signal-off”的狀態(tài)。而當(dāng)體系中出現(xiàn)Pb2+時(shí)，Pb2+剪切掉互補(bǔ)底物鏈探針，進(jìn)而使hemin/G-四鏈體離開電極表面，從而引起ECL信號(hào)的恢復(fù)。因此“on-off-on”檢測(cè)最終信號(hào)與目標(biāo)物 Pb2+的濃度成正比，可以得到超靈敏的 Pb2+傳感器。該傳感器的線性響應(yīng)范圍為