基于磁性納米復(fù)合探針檢測(cè)水中鉛離子的生物傳感器研制.pdf

1、目的：
　　通過(guò)對(duì)環(huán)境水體中二價(jià)鉛離子（Pb2+）特異性DNA酶（DNA enzyme，DNAzyme）的篩選，選定對(duì)Pb2+特異性高的DNA酶，再通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則將磁珠酶鏈復(fù)合體(MB-GR-5E)與納米金底物鏈復(fù)合體(AuNP-HRP-GR-5S)組裝，構(gòu)建一種新型的納米生物傳感器比色法檢測(cè)Pb2+，從而建立一種簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)Pb2+的新型檢測(cè)方法。
　　方法：
　　1.對(duì)環(huán)境水體中Pb2+特異性DNAzyme

2、的篩選:根據(jù)文獻(xiàn)查閱的結(jié)果重點(diǎn)篩選出8-17DNAzyme、GR-5DNAzyme兩種DNAzyme。將此兩種DNAzyme與Pb2+進(jìn)行反應(yīng)，運(yùn)用聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳分析其對(duì)Pb2+的特異性。
　　2.AuNP-HRP-GR-5S的組裝制備及表征分析:首先將辣根過(guò)氧化物酶(peroxidase horseradish，HRP)通過(guò)靜電吸附作用與納米金(goldnanoparticals，AuNPs)結(jié)合，再將巰基修飾的

3、底物鏈(GR-5S)以金硫鍵與結(jié)合有HRP的AuNPs相連，最后以牛血清白蛋白封閉納米金表面剩余的結(jié)合位點(diǎn)，至此，功能化的AuNP-HRP-GR-5S即構(gòu)建完畢。利用紫外-可見(jiàn)光吸收光譜對(duì)AuNPs及其復(fù)合物進(jìn)行特征性吸收峰表征;利用原子力顯微鏡(AFM)技術(shù)對(duì)AuNPs及其復(fù)合體進(jìn)行形貌表征;利用HRP顯色實(shí)驗(yàn)對(duì)AuNP-HRP-GR-5S上的HRP進(jìn)行定性定量分析;利用熒光探針雜交實(shí)驗(yàn)對(duì)AuNP-HRP-GR-5S上的GR-5S進(jìn)行

4、定性定量分析。
　　3.MB-GR-5E的組裝制備及表征分析:首先使氨基化MBs在戊二醛的作用下發(fā)生氨基基團(tuán)醛基化，再將氨基化修飾的DNA酶鏈GR-5E通過(guò)第二次氨基醛基化與MBs穩(wěn)定連接，最后以封閉劑封閉MBs上剩余的醛基化位點(diǎn)，利用2 mol/L的NaCl在48h內(nèi)對(duì)MB-GR-5E進(jìn)行老化加固，至此，功能化的MB-GR-5E即構(gòu)建完畢。利用熒光探針雜交實(shí)驗(yàn)對(duì)MB-GR-5E上的GR-5E進(jìn)行定性定量分析。
　　4.納米

5、生物傳感器的雜交制備:將制備好的AuNP-HRP-GR-5S與MB-GR-5E以一定的體積比例進(jìn)行混合，置于恒溫振蕩儀中進(jìn)行雜交。雜交至上清溶液開(kāi)始微紅，提示雜交完畢，后經(jīng)磁分離洗滌，該生物傳感器制備完畢。
　　5.納米生物傳感器檢測(cè)的條件優(yōu)化:通過(guò)摸索AuNP-HRP-GR-5S與MB-GR-5E的雜交體積比例、雜交時(shí)間，雜交后雙鏈與待檢樣品反應(yīng)的體積比例、反應(yīng)時(shí)間以及磁分離后上清與TMB反應(yīng)的體積比例、反應(yīng)時(shí)間等多個(gè)條件，以最

6、高信噪比為判斷標(biāo)準(zhǔn)對(duì)該生物傳感器進(jìn)行全面的優(yōu)化。
　　6.該納米生物傳感器對(duì)Pb2+的快速檢測(cè):Pb2+特異性識(shí)別并切割DNA酶及其底物鏈雜交形成的雙鏈，使生物傳感器發(fā)生解鏈并斷裂，在TMB的作用下能引起磁分離上清（上清中存留僅結(jié)合有HRP的斷裂的底物鏈）顏色和吸收光譜的變化。利用該納米生物傳感器對(duì)不同濃度梯度（1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L、10μmol/L）的Pb2+和其他常見(jiàn)水體金屬離子

7、(Zn2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Ag+、Ni2+、Fe2+、Co2+、Hg2+)以及陰離子(NO3-、CO3-、Cl-、SO42-、HPO42-、H2PO4-)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)肉眼觀察顏色變化和雙波段檢測(cè)法(A650-A490)對(duì)該納米生物傳感器檢測(cè)方法及穩(wěn)定性等進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果：
　　1.對(duì)環(huán)境水體中Pb2+特異性DNAzyme的篩選:由PAGE膠結(jié)果篩選出GR-5DNAzyme對(duì)Pb2+更具特

8、異性，本文中將其酶鏈命名為GR-5E，相應(yīng)的底物鏈命名為GR-5S。
　　2.AuNP-HRP-GR-5S的組裝制備及表征分析:由紫外-可見(jiàn)光光譜圖發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)中的納米金在520 nm處出現(xiàn)吸收峰，與直徑為15nm納米金的特征性吸收峰相吻合。隨著HRP和GR-5S的依次加入引起特征性吸收峰的依次右移，可初步推斷AuNPs與HRP和GR-5S成功連接。由AFM表征圖發(fā)現(xiàn)裸納米金的粒徑在15nm左右而AuNP-HRP-GR-5S的粒徑在

9、16～17 nm左右，更加明確了AuNP-HRP-GR-5S的成功組裝。由顯色試驗(yàn)結(jié)果分析計(jì)算，發(fā)現(xiàn)每個(gè)AuNP表面平均可以連接10～13個(gè)HRP分子。由熒光探針雜交試驗(yàn)結(jié)果分析計(jì)算，發(fā)現(xiàn)每個(gè)AuNP表面平均可以連接16個(gè)GR-5S。
　　3.MB-GR-5E的組裝制備及表征分析:由熒光探針雜交試驗(yàn)結(jié)果分析計(jì)算，發(fā)現(xiàn)1μg MBs表面大約可以結(jié)合0.53 pmol的GR-5E。
　　4.納米生物傳感器的雜交制備:由AuNP-

10、HRP-GR-5S與MB-GR-5E雜交前后磁分離得到的上清溶液從深紅到微紅再到無(wú)色透明的顏色變化，可以初步確定兩者最適的雜交比例，同時(shí)結(jié)合最高信噪比這一判斷標(biāo)準(zhǔn)，從而制備出本實(shí)驗(yàn)中性?xún)r(jià)比最高的納米生物傳感器。
　　5.生物傳感器的條件優(yōu)化:對(duì)本納米生物傳感器的各項(xiàng)檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)AuNP-HRP-GR-5S與MB-GR-5E在體積比為5∶1，雜交時(shí)間為25min時(shí)剛好達(dá)到飽和雜交;組裝好的傳感器與待檢樣品在體積比為1∶1，

11、反應(yīng)時(shí)間為30min，磁分離后上清液與3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺體積比為1∶3，反應(yīng)時(shí)間為15min時(shí)檢測(cè)出的信噪比最高，說(shuō)明以上條件為最佳檢測(cè)條件。
　　6.該納米生物傳感器對(duì)Pb2+的快速檢測(cè):在條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對(duì)不同濃度梯度的Pb2+和其他常見(jiàn)水體金屬離子以及陰離子進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)磁分離后上清顏色的變化和雙波段檢測(cè)法計(jì)算ΔA(ΔA=A650-A490)的值分析發(fā)現(xiàn):該納米生物傳感器特異性良好，基本不與其他常見(jiàn)水體金屬離

12、子以及陰離子發(fā)生交叉反應(yīng)，且能在混合金屬離子以及混合陰離子溶液中檢出Pb2+;靈敏度較高，對(duì)Pb2+的最低檢測(cè)限為32 pmol/L（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)飲用水Pb2+濃度上限4.8nmol/L），已處于目前同類(lèi)傳感器較高水平;檢測(cè)過(guò)程只需要約一個(gè)小時(shí)，相比大型儀器至少需2個(gè)小時(shí)，操作簡(jiǎn)便，且在Pb2+濃度高時(shí)無(wú)需使用檢測(cè)儀器，肉眼即可獲得定性的檢測(cè)結(jié)果;穩(wěn)定性較好，可在16天（4℃保存）內(nèi)保持分析結(jié)果基本一致，并可在約3個(gè)月內(nèi)保持實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定下

13、降趨勢(shì)，根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可測(cè)量Pb2+濃度。
　　結(jié)論：
　　本研究通過(guò)篩選出對(duì)Pb2+特異性高的DNAzyme，并分別組裝AuNP-HRP-GR-5S與MB-GR-5E，將兩者雜交制備成所需的納米生物傳感器，經(jīng)過(guò)條件的優(yōu)化實(shí)現(xiàn)了對(duì)Pb2+的高特異性和高靈敏度檢測(cè)，并可在16天（4℃保存）內(nèi)穩(wěn)定檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間可達(dá)3個(gè)月之久，操作簡(jiǎn)便、部分結(jié)果無(wú)需借助大型檢測(cè)儀器，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)也為其他水體重金屬離子的檢測(cè)提