高效農(nóng)藥殘留物檢測酶納米生物傳感器的研制.pdf

1、長期使用農(nóng)藥引起農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留超標(biāo),對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成極大危害。有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥是最常見的兩類農(nóng)藥,也是目前為止仍然最廣泛使用的農(nóng)藥,它們是一種神經(jīng)毒物,會抑制人及動物體內(nèi)膽堿酯酶活性,引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂,出現(xiàn)中毒癥狀,以至危及生命。近年來,農(nóng)藥殘留問題已經(jīng)受到了世界范圍的關(guān)注。隨著人們食品安全意識的不斷增強,改善農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)已迫在眉睫。
　　 農(nóng)藥殘留常用的檢測方法為氣相、液相色譜法、質(zhì)譜法以及波譜法

2、等,通常耗時長、成本高,難以滿足現(xiàn)場快速檢測的需要。因此,急需研究一些快速、靈敏、便捷的檢測方法,將高農(nóng)藥殘留的農(nóng)產(chǎn)品阻擋在市場之外,以杜絕食品安全事故的發(fā)生。生物傳感分析技術(shù)與傳統(tǒng)方法相比具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、能在線檢測等優(yōu)點,在環(huán)境監(jiān)測、食品檢驗等方面得到高度重視和廣泛應(yīng)用。
　　 乙酰膽堿酯酶(AChE)生物傳感器廣泛應(yīng)用于有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的測定。由于乙酰膽堿酯酶能夠選擇性的催化底物水解,且其

3、催化活性能被有機磷農(nóng)藥所抑制,利用這一特性可制成用于測定有機磷農(nóng)藥含量生物傳感器。為了提高傳感器的靈敏度,通常在制備傳感器時,在基礎(chǔ)電極上修飾某種電化學(xué)催化劑,以增強傳感器對底物的響應(yīng)信號。
　　 納米材料具有獨特的物理和化學(xué)特性,能促進(jìn)生物分子的活性中心與電極間的直接電子交換,同時最大限度地保持生物分子的活性。因此,將納米技術(shù)應(yīng)用于生物分子電化學(xué)分析研究,有利于創(chuàng)新性地建立一些新理論、新技術(shù)和新方法,將是一個很有前景的領(lǐng)域。<

4、br>　　 本文旨在建立快速檢測果蔬中有機磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留的電化學(xué)酶生物傳感器。試驗以玻碳電極作為信號轉(zhuǎn)換器,分別利用納米氧化鋅和納米氧化硅以及多壁碳納米管作為電極修飾材料,構(gòu)建新型生物傳感器,并對其電化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)實驗中對粗酶液的提取條件進(jìn)行了研究。采用了Sephadex G-200層析,對鞘翅目昆蟲洋蟲的頭胸部組織粗酶提取液中的乙酰膽堿酯酶進(jìn)行了分離純化,并對純化后的酶液的性質(zhì)進(jìn)行

5、了研究。結(jié)果表明,洋蟲頭胸部乙酰膽堿酯酶粗酶的最適提取條件為:pH7.5,Triton X-100濃度為2.0％,按料液比為1:5,4℃下浸提10個小時。采用Sephadex G-200層析純化粗酶液,AChE的純化倍數(shù)為52.76倍,總蛋白含量2.37 mg,酶比活力達(dá)到13.19 OD/(min/mg),酶活回收率為85.67％。純化后的樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳測定其分子量為78.6 KDa。通過純化后的酶性質(zhì)研究,確定檢測條件為

6、:最佳反應(yīng)溫度為36℃時,抑制時間為35 min。通過敵敵畏抑制試驗檢測酶的特性,結(jié)果表明,敵敵畏在0.2—2μM范圍內(nèi),AChE抑制率與農(nóng)藥濃度呈良好的線性關(guān)系,抑制率等式為1％=(18.38c+11.25)％。當(dāng)敵敵畏在2-10μM范圍內(nèi),AChE抑制率與農(nóng)藥濃度呈另一線性關(guān)系,抑制率等式為1％(1.53c+51.66)％。檢出限為1.584±0.37μg/L。
　　 (2)采用薄膜蒸發(fā)-凍融法制備AChE脂質(zhì)體,通過正交設(shè)

7、計優(yōu)化制備工藝,以魚精蛋白沉淀法分離脂質(zhì)體與游離酶。通過計算活性包封率,確定AChE脂質(zhì)體最佳制備工藝為:根據(jù)正交試驗結(jié)果,確定最佳處方工藝,即卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為2:1,(卵磷脂+膽固醇)的質(zhì)量與AChE的質(zhì)量之比1:2,凍融時的循環(huán)次數(shù)為30次,旋轉(zhuǎn)速度為150 rpm,最佳處方工藝制得的5組脂質(zhì)體的活性包封率的平均值為89.5％。AChE脂質(zhì)體生物反應(yīng)器有效平均粒徑為7.3±0.85μm,其中85％(體系分?jǐn)?shù))的生物反應(yīng)器微粒

8、集中在7μm。AChE脂質(zhì)體生物反應(yīng)器表面電勢-78.6 mV。AChE脂質(zhì)體生物反應(yīng)器相比于同等酶含量的游離酶,具有較高的穩(wěn)定性。Porin蛋白嵌入磷脂層,構(gòu)成底物進(jìn)入通道的同時控制酶的逸出,因為酶的大小無法通過孔道。脂質(zhì)體內(nèi)酶的活性根據(jù)熒光指示劑的信號強度來測定。通過敵敵畏和西維因抑制試驗結(jié)果表明,AChE抑制率與農(nóng)藥濃度呈良好的線性關(guān)系,檢出限分別為1.13±0.29μg/L和1.36±0.35μg/L。
　　 (3)采用

9、三電極系統(tǒng)對玻碳電極進(jìn)行了預(yù)處理及活化,實驗結(jié)果表明,GCE-(CS/ALB)n對底物ATChCl的催化電流值隨著組裝層數(shù)的增多而明顯增大,(CS/ALB)多層膜最適層數(shù)為5層,(CS/ALB)5同時體現(xiàn)出了較好的穩(wěn)定性。抑制率與敵敵畏的濃度在_定范圍內(nèi)存在線性關(guān)系。在0.25-1.5μM的范圍內(nèi)抑制率回歸方程為1％=(24.45c-H2.35)％,相關(guān)系數(shù)R2為0.9981。在1.75-10μM的范圍內(nèi)抑制率回歸方程為1％=(1.86

10、c+58.76)％,相關(guān)系數(shù)R2為0.9914。檢出限為0.864±0.098μg/L。
　　 (4)采用硅酸鈉為硅源,氯化銨為沉淀劑制備納米二氧化硅。研究了硅酸鈉的濃度、乙醇與水的體積比以及pH值對納米二氧化硅粉末比表面積的影響。利用XRD衍射和掃描電子顯微鏡對產(chǎn)物進(jìn)行表征。選用最適體系制備出的納米氧化硅比表面積平均值為297.3 m2/g,表面電勢為-42.5 mV,平均粒徑為115.54±1.86 nm。(ALB/SiO2

11、)n最適層數(shù)為6。GCE-(ALB/SiO2)6對農(nóng)藥的響應(yīng)實驗結(jié)果表明,該電極靈敏度較高且抑制率與農(nóng)藥的濃度在一定范圍內(nèi)存在線性關(guān)系。GCE-(ALB/SiO2)6具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。
　　 (5)將多壁碳納米管(MWNTs)置于混酸(硝酸:硫酸=1:3)中,利用超聲波振蕩截短碳納米管、并使其與羧基鏈接,而后基于陽離子聚合電解質(zhì)殼聚糖(CS)和帶有陰離子的碳納米管之間的靜電作用,通過層層自組裝的模式均勻穩(wěn)定地形成復(fù)合殼聚

12、糖多層膜。GCE-(ALB/MWNTs)n最適層數(shù)為6層。在GCE-(ALB/MWNTs)6對農(nóng)藥的響應(yīng)實驗結(jié)果表明,農(nóng)藥抑制率與農(nóng)藥的濃度在一定范圍內(nèi)存在線性關(guān)系,檢出限為0.684±0.076μg/L。
　　 (6)采用溶膠.凝膠法制備Al摻雜的ZnO納米粉體。結(jié)合正交設(shè)計對各因素進(jìn)行優(yōu)化,得到最適制備條件為:醋酸鋅濃度為1.5 mol/L,(NH)3C6H15O7濃度為2 mol/L,Al摻雜質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5％,V(乙醇):

13、V(H2O)為1.5:1和煅燒溫度1200℃。XRD分析和EDS能譜分析表明Al元素已經(jīng)融合進(jìn)了ZnO的晶格當(dāng)中。GCE-(ALB/ZnO)n最適層數(shù)為5層。GCE-(ALB/ZnO)5對展現(xiàn)了良好的光電性能,當(dāng)紫外光與可見光同時存在時,經(jīng)Al-ZnO修飾的電極具有較高的響應(yīng)電流。農(nóng)藥抑制率與農(nóng)藥的濃度在一定范圍內(nèi)存在線性關(guān)系,檢出限為0.76±a:0.087μg/L。
　　 (7)將納米ZnO、MWNTs和納米氧化硅這三種納米

14、材料,經(jīng)過有序的組合構(gòu)建酶最終獲得了以(ALB/MWNTs/SiO2/ZnO)4膜為基礎(chǔ)的性能優(yōu)越的電化學(xué)生物傳感器。根據(jù)新型傳感器的性能優(yōu)化工作條件,即反應(yīng)體系總體積10 mL,底物反應(yīng)時間15 min,體系溫度36℃,同時伴隨光源輻射,反應(yīng)體系pH值為7.4,農(nóng)藥樣品抑制12 min,加入1.25 mM底物,反應(yīng)15 min。在敵敵畏響應(yīng)實驗中,農(nóng)藥抑制率與農(nóng)藥的濃度在一定范圍內(nèi)存在線性關(guān)系,檢出限為0.53±0.096μg/L。<

15、br>　　 (8)實驗中考察了新型傳感器的抗干擾能力和可再生能力,這兩方面的特性直接影響著傳感器的實際應(yīng)用。在研究重金屬離子、農(nóng)藥以及其他化合物對AChE生物傳感器測定時的影響過程中,發(fā)現(xiàn)酶納米復(fù)合結(jié)構(gòu)生物傳感器在含有重金屬離子和不同農(nóng)藥的溶液中基本不受影響,含有抗壞血酸的體系對傳感器的影響較大。篩選出三種物質(zhì)來活化酶傳感器可再生的活化物。通過比較選擇碘解磷定(2-PAM)作為傳感器可再生的活化物。結(jié)果表明,所制備的傳感器可以重復(fù)使用

16、6次,活性仍在80％以上。
　　 (9)采用優(yōu)化好的體系制備酶納米生物傳感器,測定對兩類中的8種農(nóng)藥的電化學(xué)響應(yīng),結(jié)果表明8種農(nóng)藥抑制率分別在一定范圍內(nèi)與農(nóng)藥濃度呈良好的線性關(guān)系,且具有較低的檢出限。利用乙酰膽堿酯酶生物傳感器技術(shù),以蘋果、小白菜和黃瓜為樣品,采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行分析,測定蔬菜水果中有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留。酶納米傳感器檢測三種果蔬中兩類農(nóng)藥殘留時,均表現(xiàn)出良好的精確度、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性,可以用于實際的檢測,且