PI3K-AKT和MEK-ERK通路調(diào)控H3K27me3甲基化酶和去甲基化酶基因表達(dá)的研究.pdf

1、組蛋白甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾,參與基因的表達(dá)調(diào)控。組蛋白H3K27me3是抑制基因轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳修飾標(biāo)記之一,可以抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。目前研究發(fā)現(xiàn),組蛋白H3K27me3受組蛋白甲基化酶和去甲基化酶的調(diào)控。其中,Zester同源增強(qiáng)子2是組蛋白H3K27甲基化轉(zhuǎn)移酶,EZH1是它的同源物,它們都是Polycomb蛋白家族的成員。UTX和JMJD3是組蛋白H3K27me3去甲基化酶。PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)組蛋白甲基化酶EZH2基

2、因表達(dá)已經(jīng)有報(bào)道,但在成肌細(xì)胞分化過(guò)程中是否調(diào)控組蛋白H3K27甲基化酶和去甲基化酶的表達(dá)還不清楚,我們用小鼠成肌細(xì)胞C2C12為研究材料,采用免疫印跡、染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatinimmunoprecipitation,CHIP)、定量PCR(Q-PCR)的方法研究PI3K/AKT信號(hào)通路在成肌細(xì)胞分化階段對(duì)組蛋白H3K27甲基化酶EZH1/EZH2和去甲基化酶UTX/JMJD3的表達(dá)調(diào)控。此外,在多種腫瘤組織中檢測(cè)到EZH2

3、存在過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象,UTX和JMJD3也被檢測(cè)到發(fā)生突變或者表達(dá)下降。MEK/ERK信號(hào)通路是生物體內(nèi)廣泛存在的一條信號(hào)通路,參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡等生命過(guò)程。在某些癌癥細(xì)胞中,MER/ERK信號(hào)通路參與調(diào)控EZH2基因的表達(dá)。為了進(jìn)一步研究這條通路對(duì)組蛋白甲基化酶和去甲基化酶的調(diào)控。我們以C2C12、C127、NIH3T3、HEPA1-61-6、RD五種細(xì)胞系為研究對(duì)象,用RT-PCR和Western-Bloting方法分

4、析檢測(cè)MER-ERK信號(hào)通路對(duì)組蛋白H3K27甲基化酶EZH2/EZH1基因和去甲基化酶UTX/JMJD3基因的表達(dá)。結(jié)果如下:
　　磷酸化的AKT在成肌細(xì)胞分化過(guò)程中逐漸升高,EZH1和JMJD3蛋白表達(dá)變化不明顯,EZH2蛋白表達(dá)降低,到第6和第7d蛋白降到最低值,UTX蛋白表達(dá)升高。
　　成肌細(xì)胞分化過(guò)程中用PI3K/AkT信號(hào)通路激活劑處理24h后,Myogenin和MCK蛋白表達(dá)升高,H3K27me3在Myogen

5、in基因啟動(dòng)子區(qū)和MCK基因啟動(dòng)子及增強(qiáng)子區(qū)的富集與對(duì)照組相比降低。UTX蛋白表達(dá)略微升高,JMJD3、EZH1和EZH2蛋白與對(duì)照相比變化不明顯。用PI3K/AKT號(hào)通路抑制劑處理24h后,Myogenin和MCK蛋白表達(dá)降低,H3K27me3在Myogenin基因啟動(dòng)子區(qū)和MCK基因啟動(dòng)子及增強(qiáng)子區(qū)的富集與對(duì)照組相比升高,UTX和EZH2蛋白表達(dá)均降低,其中JMJD3和EZH1蛋白表達(dá)降低不明顯。
　　不同濃度的MEK/ERK

6、信號(hào)通路抑制劑U0126(0、10、20、40umol/L)處理24h后,在五種細(xì)胞磷酸化的ERK1/2表達(dá)水平隨著濃度的升高逐漸降低;EZH1和EZH2基因mRNA表達(dá)水平與對(duì)照相比有不同程度的降低,EZH1基因mRNA表達(dá)變化沒(méi)有達(dá)到顯著水平,EZH2mRNA在NIH3T3、C2C12、RD、HEPA1-6四種細(xì)胞表達(dá)變化達(dá)到顯著水平(P<0.05),EZH2蛋白表達(dá)在五種細(xì)胞系內(nèi)都降低,其中C127細(xì)胞變化最不明顯,HEPA1-6

7、細(xì)胞變化最為顯著。組蛋白H3K27me3去甲基化酶UTX基因在C2C12、C127、NIH3T3、HEPA1-6、RD五種細(xì)胞mRNA表達(dá)變化不明顯,JMJD3基因mRNA表達(dá)變化達(dá)到顯著水平(P<0.05),JMJD3蛋白表達(dá)普遍升高,但在RD細(xì)胞蛋白表達(dá)升高不明顯。
　　對(duì)HEPA1-6細(xì)胞免疫熒光檢測(cè),EZH1和UTX蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)都有表達(dá),EZH2蛋白在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)比較強(qiáng),JMJD3在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)比較強(qiáng)。加入MEK

8、/ERK信號(hào)通路抑制劑U0126處理細(xì)胞24h后,與對(duì)照相比,EZH2、EZH1、UTX、JMJD3變化不明顯。
　　MEK/ERK信號(hào)通路抑制劑U0126處理HEPA1-6和RD兩種細(xì)胞系24h后,在兩種細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)EZH1表達(dá)變化不明顯,EZH2蛋白表達(dá)顯著降低。UTX和JMJD3蛋白在HEPA1-6細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)升高,在RD細(xì)胞細(xì)胞核沒(méi)有明顯變化。
　　用MEK/ERK信號(hào)通路抑制劑U0126處理HEPA1-6細(xì)胞

9、,不同的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)蛋白表達(dá)的變化。U0126處理2hP-ERK1/2降低,隨后表達(dá)水平逐漸升高,到24h升高到最大,但與對(duì)照相比仍然降低。EZH1沒(méi)有明顯變化。EZH2蛋白處理8h后蛋白表達(dá)減弱明顯,24h蛋白表達(dá)降低到最低水平。JMJD3和UTX蛋白在處理4h后表達(dá)升高到最大值,隨后表達(dá)逐漸減弱。
　　siRNA-ERK1、siRNA-ERK2、siRNA-ERK1/2干擾HEPA1-6細(xì)胞,EZH2和EZH1蛋白表達(dá)都有不同程

10、度的降低,EZH1變化不明顯,JMJD3蛋白表達(dá)明顯升高,但UTX在siRNA-ERK1干擾后蛋白升高不明顯,siRNA-ERK2和siRNA-ERK1/2干擾后蛋白表達(dá)升高明顯。
　　結(jié)論:PI3K/AKT信號(hào)通路在成肌細(xì)胞分化過(guò)程中可能參與調(diào)控EZH2和UTX的表達(dá),但可能有別的信號(hào)通路共同參與調(diào)控。MEK/ERK信號(hào)通路對(duì)EZH1沒(méi)有明顯的調(diào)控作用,可能參與調(diào)控EZH2、UTX和JMJD3基因的表達(dá),但這種調(diào)控具有細(xì)胞特異性