組蛋白去甲基化酶LSD1促進腫瘤細(xì)胞“干性”和侵襲轉(zhuǎn)移的機制研究.pdf

1、我國是肝癌和胃癌高發(fā)國家之一。隨著對腫瘤生物學(xué)特性不斷認(rèn)識的深入，近年來腫瘤診療新技術(shù)發(fā)展迅速，但肝癌和胃癌患者整體預(yù)后仍不佳，進展期肝癌和胃癌臨床療效極差。因此研究肝癌和胃癌惡性生長和轉(zhuǎn)移的調(diào)控機制具有重要的科學(xué)意義和臨床價值。
　　腫瘤干細(xì)胞(Cancer Stem Cells，CSCs)學(xué)說為認(rèn)識肝癌惡性生長的機制提供了新的切入點。肝癌干細(xì)胞具有極強的自我更新能力，是肝癌惡性增殖的“根源細(xì)胞”;因此探索肝癌干細(xì)胞自我更新的調(diào)

2、控機制，是腫瘤研究的重要課題。表觀遺傳修飾是基因表達調(diào)控的重要機制，在自我更新、增殖和分化等細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。組蛋白甲基化修飾作為一種重要的表觀遺傳修飾方式，其調(diào)控異常參與腫瘤等眾多疾病發(fā)生發(fā)展，但在肝癌干細(xì)胞自我更新中的作用機制尚不明確。賴氨酸特異性去甲基化酶LSD1(Human lysine specific demethylases1，LSD1)是單胺氧化酶家族主要成員，在黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)參與下，LSD1可

3、以特異去除組蛋白H3的K4和K9的二甲基和一甲基（H3K4me1/2和H3K9me1/2）的修飾。既往研究表明，LSD1維持多潛能干細(xì)胞(iPS)、胚胎干細(xì)胞(ESC)[1，2]和MLL-AF9白血病干細(xì)胞致瘤能力，并在多種惡性腫瘤組織過表達，提示LSD1可能參與了肝癌發(fā)生發(fā)展，在調(diào)控包括干細(xì)胞特性等多種惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用。
　　腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移是胃癌導(dǎo)致患者死亡的重要原因，而腫瘤的侵襲和遷移是腫瘤轉(zhuǎn)移的最重要的環(huán)節(jié)，是

4、腫瘤惡性生物學(xué)行為之一，因此探討腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制在研究胃癌的發(fā)展過程具有重要的意義。表觀遺傳學(xué)修飾特別是組蛋白甲基化在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中具有最重要的作用。已有研究表明，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中LSD1起到重要的作用，在促進腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)密切相關(guān)。例如，LSD1與Snail1的SNAG結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制E-cadherin基因的表達，促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和侵襲轉(zhuǎn)移。但是，目前尚不清楚LSD1是否調(diào)控胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，研究相關(guān)

5、分子機制，有望進一步揭示調(diào)控胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的表觀遺傳學(xué)機制。
　　有鑒于此，本研究第一部分主要探討LSD1調(diào)控肝癌干細(xì)胞的自我更新特性的分子機制；第二部分研究LSD1在胃癌侵襲及轉(zhuǎn)移中的作用及分子基礎(chǔ)。研究內(nèi)容和主要結(jié)果結(jié)論如下:
　　第一部分 LSD1調(diào)控Lgr5+肝癌細(xì)胞的“干性”的分子機制
　　一、LSD1在肝癌組織中的表達及臨床腫瘤學(xué)意義
　　1、肝癌細(xì)胞高表達LSD1；
　　2、LSD1在肝癌組織的

6、表達與病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且分化程度低及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織LSD1表達高；
　　3、肝癌組織高表達LSD1與患者五年生存率較低顯著相關(guān)。
　　二、Lgr5+肝癌細(xì)胞具有“干性”特征
　　1、肝癌組織Lgr5表達與LSD1表達密切相關(guān)
　　(1)Lgr5在肝癌中表達比癌旁組織高，Lgr5與腫瘤的包膜完整性、病理學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及LSD1表達呈正相關(guān)；Lgr5表達越高的病人生存期越短；
　　

7、(2)Lgr5在肝癌細(xì)胞株和原代細(xì)胞中表達比肝永生化細(xì)胞株L02高。
　　2、Lgr5+肝癌細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性
　　(1)Lgr5+肝癌細(xì)胞干性基因表達較高；
　　(2)含血清培養(yǎng)后，干性基因表達水平降低，分化成熟肝細(xì)胞的標(biāo)志物升高；
　　(3)Lgr5+肝癌細(xì)胞體外成球能力高于Lgr5-細(xì)胞；
　　(4)Lgr5+肝癌干細(xì)胞比Lgr5-肝癌細(xì)胞具有更強的化療抵抗能力；
　　(5)Lgr5+肝癌細(xì)

8、胞體內(nèi)成瘤能力顯著強于Lgr5-細(xì)胞。
　　三、LSD1調(diào)控Lgr5+肝癌干細(xì)胞的“干性”特征
　　1、Lgr5+肝癌干細(xì)胞的LSD1表達水平顯著高于Lgr5-肝癌細(xì)胞；
　　2、過表達LSD1能夠促進肝癌細(xì)胞的自我更新能力及化療藥物抵抗；
　　3、在Lgr5+肝癌干細(xì)胞中，干擾LSD1表達則降低其自我更新能力及化療抵抗;
　　四、LSD1上調(diào)WNT通路活性，維持Lgr5+肝癌干細(xì)胞的“干性”特征
　

9、　1、LSD1通過降低Prickle1和APC基因啟動子周圍H3K4me1/2水平，抑制Prickle1和APC的蛋白表達，激活WNT信號通路;
　　2、WNT信號活性在LSD1維持Lgr5+肝癌干細(xì)胞“干性”特征發(fā)揮重要作用;
　　五、LSD1抑制劑可以作為肝癌化療藥物的增強劑
　　1、LSD1抑制劑上調(diào)Prickle1和APC表達水平；
　　2、LSD1抑制劑抑制肝癌干細(xì)胞成球能力；
　　3、LSD1抑

10、制劑抑制肝癌干細(xì)胞化療藥物抵抗;
　　4、在裸鼠體內(nèi)，LSD1抑制劑治療降低肝癌干細(xì)胞成瘤能力，抑制肝癌干細(xì)胞化療藥物抵抗;
　　第二部分 LSD1促進胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制研究
　　一、LSD1在胃癌中的表達及意義
　　1、胃癌組織高表達LSD1;
　　2、胃癌組織LSD1表達水平與病理學(xué)分化程度、腫瘤侵潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān);
　　3、LSD1表達高的病人五年生存期較短。
　　二

11、、LSD1促進胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力
　　1、敲除LSD1后，可抑制胃癌細(xì)胞侵襲和遷移能力;
　　2、LSD1抑制劑處理，可降低胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力;
　　三、LSD1調(diào)控胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制
　　1、過表達LSD1降低WISP-2基因啟動子區(qū)域H3K4me1/2水平，抑制其轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，促進TGF-β信號通路活化;
　　2、內(nèi)源性LSD1抑制WISP2基因轉(zhuǎn)錄，促進內(nèi)源性TGF-β信號活性;
　　

12、3、LSD1抑制WISP2，增加胃癌細(xì)胞對TGF-β所調(diào)控EMT的敏感性;
　　4、LSD1增加胃癌細(xì)胞對TGF-β所調(diào)控侵襲轉(zhuǎn)移的敏感性;
　　四、LSD1和WISP-2在胃癌組織的表達水平及其臨床意義
　　1、胃癌細(xì)胞WISP-2表達水平與胃癌惡性程度相關(guān);
　　(1)WISP-2在癌旁組織呈陽性，而在癌組織和轉(zhuǎn)移灶組織可見不同程度的低表達表達，且轉(zhuǎn)移灶的表達總體較低;WISP-2表達在細(xì)胞漿和膜;
　

13、　(2)相同胃癌組織連續(xù)切片IHC染色發(fā)現(xiàn)，相同視野LSD1高表達，而WISP-2低表達;分析不同患者胃癌組織則表明，LSD1高表達癌組織中WISP-2低表達，而LSD1低表達癌組織則WISP2高表達。
　　2、WISP-2蛋白在胃癌組織的表達與臨床病理學(xué)的相關(guān)性
　　(1)在307例胃癌臨床樣本中，統(tǒng)計結(jié)果顯示W(wǎng)1SP-2的表達與病理學(xué)分化程度、腫瘤侵潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān);
　　(2)LSD1在胃癌的表達與其發(fā)

14、生和演進相關(guān)。
　　3、LSD1聯(lián)合WISP-2的表達對胃癌患者對患者預(yù)后和轉(zhuǎn)移的影響
　　(1)WISP-2低表達組織的患者五年生存率低于高表達患者;
　　(2)WISP-2高表達患者無轉(zhuǎn)移生存期高于低表達患者;
　　(3)腫瘤中WISP-2高表達并且LSD1低表達時患者生存時間最長;而癌組織LSD1高表達且WISP-2低表達，則患者生存時間最短;
　　(4)癌組織LSD1低表達且WISP-2高表達時患者

15、沒有轉(zhuǎn)移生存時間是最長的;而LSD1高表達并且WISP-2低表達的患者，其無轉(zhuǎn)移生存時間是最短的;
　　(5)聯(lián)合分析LSD1與WISP-2表達水平，可以更好地預(yù)測胃癌患者預(yù)后和發(fā)生轉(zhuǎn)移概率。
　　綜上所述，本研究的主要結(jié)論是:
　　1、LSD1在維持肝癌干細(xì)胞的自我更新和高致瘤性中具有重要的作用。
　　2、LSD1通過降低Prickle1和APC基因啟動子區(qū)域H3 K4me1/2水平，抑制Prickle1和AP

16、C基因表達，增加WNT信號通路活性，參與維持肝癌干細(xì)胞自我更新和高致瘤性。
　　3、LSD1抑制劑可以作為肝癌化療藥物的增強劑。
　　4、LSD1促進胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。
　　5、LSD1通過降低WISP-2啟動子區(qū)域H3K4me1/2水平，激活TGF-β信號通路，促進胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　本研究首次報道了LSD1維持肝癌干細(xì)胞“干性”特征的作用機制，進一步深入認(rèn)識了肝癌干細(xì)胞化療耐藥的分子機制。LSD1維持肝癌干

17、細(xì)胞維持自我更新的分子機制為:LSD1通過修飾APC和Prickle1基因啟動子區(qū)域的H3K4me1/2，抑制APC和Prickle1蛋白的表達，激活WNT信號通路。我們認(rèn)為，LSD1可能是肝癌治療的一個潛在分子靶標(biāo)。
　　本研究首次闡述了LSD1促進胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用新機制。其促進胃癌侵襲轉(zhuǎn)移分子機制為:LSD1通過降低WISP-2啟動子區(qū)域H3K4me1/2水平，抑制WISP-2基因表達，激活TGF-β信號通路，促進胃癌的侵襲