組蛋白去甲基化酶RBP2通過調(diào)控α-SMA和vimentin參與肝硬化的發(fā)生.pdf

1、目的:
　　 研究一種新型組蛋白去甲基化酶在肝硬化中的作用，了解表觀遺傳學(xué)分子在人類疾病中廣泛作用，探索此類分子作為疾病治療潛在靶標(biāo)的可能性。
　　 方法:
　　 1.對20對（肝硬化組織和肝正常組織）標(biāo)本中RBP2的水平進(jìn)行了免疫組化的檢測，確定了RBP2在這些組織中表達(dá)的差異情況，并對結(jié)果進(jìn)行了歸納分析，為研究其在肝硬化中的功能奠定基礎(chǔ)。
　　 2.進(jìn)行分子和細(xì)胞水平的實驗，應(yīng)用特異性的RBP2干擾R

2、NA處理肝星形細(xì)胞，檢測RBP2敲減后對于肝纖維化相關(guān)的α-SMA和vimentin表達(dá)的影響，然后用RBP2過表達(dá)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測α-SMA和vimentin在RNA和蛋白水平上的變化情況，確定RBP2是否對于上述兩種分子有調(diào)控作用，同時用克隆形成實驗檢測了RBP2敲減對于肝星形細(xì)胞增殖的作用，并且用可以誘導(dǎo)肝纖維化的因素，如TGF-β來處理細(xì)胞，檢測RBP2，α-SMA和vimentin的表達(dá)變化情況。先用特異性的RBP2干擾R

3、NA預(yù)處理肝星形細(xì)胞，再用TGF-β來刺激，檢測α-SMA和vimentin的表達(dá)，以及肝星形細(xì)胞增殖的變化，以此來確定TGF-β是否通過調(diào)控RBP2來調(diào)節(jié)α-SMA和vimentin的表達(dá)。具體方法如下:
　　 (1).利用Invitrogen公司的Lipofectamine2000把特異性的RBP2干擾RNA及其對照干擾RNA轉(zhuǎn)入肝星形細(xì)胞LX-2中，72小時后收獲細(xì)胞，用Trizol提取總RNA。隨后用Fermentas公

4、司反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。以上面得到的cDNA為模板，再用TakaraSYBR熒光定量PCR試劑盒檢測RBP2mRNA的表達(dá)水平，以確定其干擾效率;同時又檢測α-SMA和vimentinmRNA的表達(dá)變化。蛋白水平的變化用WesternBlot方法分析。
　　 (2).利用上述相同方法敲減RBP2的表達(dá)后，從培養(yǎng)液中取出細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，每組300個細(xì)胞，用3ml培養(yǎng)基懸于六孔板中，在孵箱培養(yǎng)2周長出肉眼可見克隆后，固定

5、細(xì)胞，利用吉姆薩染色，計算克隆的數(shù)目，即用克隆形成實驗檢測細(xì)胞分裂增殖能力的高低。
　　 (3).用羅氏公司的轉(zhuǎn)染試劑把RBP2的高表達(dá)質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)入肝星形細(xì)胞LX-2中，48小時后，收細(xì)胞提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實時定量PCR的檢測，確定α-SMA和vimentinmRNA的表達(dá)變化。蛋白水平的檢測用WesternBlot的方法。
　　 (4).用TGF-β來處理肝星形細(xì)胞LX-2，48小時后，收細(xì)胞提取RNA，

6、反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實時定量PCR的檢測，確定RBP2，α-SMA和vimentinmRNA的表達(dá)變化。蛋白水平的檢測用WesternBlot的方法。
　　 (5).先用特異性的RBP2干擾RNA處理肝星形細(xì)胞LX-2，24小時后，加入TGF-β繼續(xù)處理48小時，收獲細(xì)胞，提取蛋白和RNA，分別進(jìn)行WesternBlot和實時定量PCR的檢測，確定RBP2，α-SMA和vimentin蛋白和mRNA的表達(dá)變化。同時用同樣方法進(jìn)行克隆形成

7、實驗，檢測肝星形細(xì)胞增殖能力的變化。
　　 3.用大鼠造肝硬化模型實驗:購買15只適齡大鼠，隨機(jī)分成三組，其中6只為正常對照組，另外9只為實驗組。實驗組大鼠飲用含10％酒精的水，并以高脂低蛋白的食物飼養(yǎng)，同時在皮下每4天注射一次混合液（40％CCl4和60％橄欖油的混合物），劑量為0.5ml/克;給與對照組大鼠正常飲食飲水并皮下注射相同劑量的生理鹽水。每隔4天稱量一次大鼠的體重。6周后，先用適量的麻醉藥品將大鼠麻醉，再對其進(jìn)行解

8、剖，分離出肝臟和脾臟，并進(jìn)行稱重，記錄好數(shù)據(jù)后，整理分析。分離出的肝組織一部分放于中性福爾馬林中，以備包埋切片，做HE和免疫組化檢測之用;另一部分凍于-80度冰箱，以提取RNA之用。
　　 結(jié)果:
　　 1.RBP2的蛋白水平在肝硬化組織中比肝正常組織中顯著升高，免疫組化染色顯示RBP2在肝硬化組織中陽性細(xì)胞個數(shù)顯著增多。
　　 2.肝星形細(xì)胞LX-2轉(zhuǎn)入特異性的RBP2干擾RNA72小時后，RBP2的mRNA和

9、蛋白表達(dá)都顯著降低，同時由于RBP2表達(dá)的減少，α-SMA和vimentin的表達(dá)也隨之降低。提示RBP2可能通過調(diào)節(jié)α-SMA和vimentin的表達(dá)來參與肝纖維化和肝硬化的發(fā)生。
　　 3.通過克隆形成實驗，我們發(fā)現(xiàn)肝星形細(xì)胞LX-2轉(zhuǎn)入特異性的RBP2干擾RNA72小時后，細(xì)胞的克隆形成能力和對照組相比明顯受到抑制。
　　 4.肝星形細(xì)胞LX-2轉(zhuǎn)入RBP2高表達(dá)質(zhì)粒48小時后，RBP2的mRNA和蛋白表達(dá)都顯著上

10、升，同時由于RBP2表達(dá)的增高，α-SMA和vimentin的表達(dá)也隨之升高。
　　 5.用TGF-β處理肝星形細(xì)胞LX-248小時后，RBP2，α-SMA和vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)都有較明顯的升高。
　　 6.預(yù)先用特異性的RBP2干擾RNA下調(diào)RBP2的表達(dá)后，再用TGF-β處理肝星形細(xì)胞LX-2，α-SMA和vimentin的mRNA和蛋白水平的表達(dá)升高都得到了逆轉(zhuǎn)，同時TGF-β使肝星形細(xì)胞增殖能力的

11、提高也得到了逆轉(zhuǎn)。
　　 7.大鼠肝硬化模型實驗表明，實驗組大鼠的肝組織出現(xiàn)了明顯的肝硬化特征。實驗組大鼠的肝臟指數(shù)（肝臟重量/體重）和脾臟指數(shù)（脾臟重量/體重）都明顯高于對照組。RBP2mRNA和蛋白的表達(dá)在實驗組大鼠的肝硬化組織中都明顯提高。
　　 結(jié)論:
　　 一些肝硬化的誘導(dǎo)因子，如TGF-β可能通過RBP2來調(diào)節(jié)與肝硬化相關(guān)的分子α-SMA和vimentin的表達(dá)來促進(jìn)肝硬化的發(fā)生。RBP2可能會成為診