組蛋白去甲基化酶PHF8對(duì)壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚的抑制作用.pdf

1、哺乳動(dòng)物的心臟在壓力負(fù)荷增加的情況下會(huì)發(fā)生心肌肥厚，以適應(yīng)增加的工作負(fù)荷，持續(xù)的心肌肥厚會(huì)導(dǎo)致心臟功能失代償，隨后發(fā)生心衰。心肌肥厚的主要病理表現(xiàn)有心肌細(xì)胞肥大、心肌細(xì)胞外基質(zhì)重建、心肌間質(zhì)增殖等。心肌細(xì)胞蛋白合成增加，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞體積增大，即心肌細(xì)胞肥大。研究證實(shí)，心肌細(xì)胞肥大的形成需要刺激信號(hào)、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄活化以及心肌表型轉(zhuǎn)化等四個(gè)環(huán)節(jié)，其最終效應(yīng)是心肌表型由“成熟型”向“胚胎型”轉(zhuǎn)化。對(duì)于心肌肥厚的機(jī)制已有諸多研究

2、，但其具體發(fā)生機(jī)制仍未明確，因而尚沒(méi)有可以確切有效預(yù)防心肌肥厚的方法。目前研究證實(shí)，在心肌肥厚的過(guò)程中，一組通常在胎兒心臟發(fā)育過(guò)程中表達(dá)的基因被重新表達(dá)，參與了心肌肥厚的病理調(diào)控。
　　組蛋白是真核生物染色質(zhì)的組成部分，組蛋白亞基的氨基端游離稱為組蛋白尾巴，組蛋白尾巴上的許多殘基可以被共價(jià)修飾，不同殘基的不同修飾可以產(chǎn)生各種不同的信號(hào)，由其他信號(hào)蛋白識(shí)別，從而可調(diào)控真核生物的基因表達(dá)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄激活或基因沉默，進(jìn)而產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)

3、。已有研究表明，組蛋白修飾與多種疾病的發(fā)病密切相關(guān)。如慢性腎臟病、腫瘤性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等，在心血管領(lǐng)域，組蛋白修飾也發(fā)揮了重要作用。
　　PHD鋅指蛋白8(PHF8)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種組蛋白去甲基化酶，可在體內(nèi)通過(guò)對(duì)組蛋白的賴氨酸殘基進(jìn)行去甲基化修飾來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。PHF8是組蛋白去甲基化酶JmjC家族中的一個(gè)成員，JmjC家族成員在正常的個(gè)體發(fā)育、分化、內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)及多種疾病的發(fā)生發(fā)展中參與重要的調(diào)節(jié)作用

4、。PHF8作為JmjC家族中的一員，它可以特異性去除抑制性組蛋白標(biāo)記H4K20me1和H3K9me1/2，而結(jié)合活性組蛋白標(biāo)志H3K4me3，在組蛋白修飾中發(fā)揮重要作用并參與發(fā)育調(diào)節(jié)及多種疾病的發(fā)生發(fā)展。但PHF8在心血管系統(tǒng)尤其心肌肥厚中的作用尚不明確。
　　目的：
　　本課題將從體內(nèi)和體外兩個(gè)部分設(shè)計(jì)試驗(yàn)，旨在探討PHF8在心肌肥厚發(fā)病中的作用，并初步探討其作用的分子生物學(xué)機(jī)制，從而為防治心肌肥厚尋找新的契機(jī)和治療靶點(diǎn)。

5、
　　方法：
　　1.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立:
　　構(gòu)建心臟特異性人PHF8基因轉(zhuǎn)基因（PHF8-Tg）小鼠。
　　2.心肌肥厚動(dòng)物模型的建立:
　　通過(guò)主動(dòng)脈縮窄術(shù)(TAC)建立壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚小鼠模型。
　　3.小鼠超聲心動(dòng)圖:
　　小鼠心臟超聲檢測(cè)小鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能。
　　4.細(xì)胞培養(yǎng)及模型建立:
　　提取原代新生大鼠心肌細(xì)胞(NRMCs)并培養(yǎng)，體外以苯腎上腺素(PE)等

6、刺激誘導(dǎo)NRMCs發(fā)生肥大性生長(zhǎng)反應(yīng)。
　　5.細(xì)胞內(nèi)PHF8干預(yù):
　　采用腺病毒載體轉(zhuǎn)染的方式干預(yù)NRMCs中PHF8的表達(dá)。
　　6.HE染色、麥胚凝集素染色、Masson染色:
　　分別顯示心肌的大體結(jié)構(gòu)、心肌細(xì)胞大小及心肌纖維化程度。
　　7.免疫印跡:
　　用于在蛋白水平檢測(cè)組織和細(xì)胞中PHF8、ANP及相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)變化。
　　8.RT-PCR:
　　用于在基因水平檢

7、測(cè)組織和細(xì)胞中PHF8、ANP、β-MHC、BNP及相關(guān)信號(hào)通路mRNA水平的變化。
　　9.3H-亮氨酸摻入試驗(yàn):
　　用于檢測(cè)心肌細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成水平。
　　10.熒光酶活性檢測(cè):
　　用于檢測(cè)心肌細(xì)胞中胚胎基因的啟動(dòng)子活性。
　　11.免疫熒光分析:用于檢測(cè)心肌細(xì)胞的大小。
　　結(jié)果：
　　1.病理性心肌肥厚下調(diào)PHF8水平:
　　在TAC手術(shù)后4周野生型C57BL/6小鼠的心肌中，

8、PHF8的表達(dá)顯著下降，在PE刺激的肥大性生長(zhǎng)的NRMCs中，我們得到了相似的結(jié)論。這些研究結(jié)果表明PHF8可能參與了心肌細(xì)胞病理性肥大的過(guò)程。
　　2.PHF8過(guò)表達(dá)抑制壓力負(fù)荷下的心肌重構(gòu):
　　接受TAC術(shù)4周后，PHF8-Tg小鼠的心功能顯著優(yōu)于野生型(wT)小鼠，左心室纖維化面積相比WT小鼠顯著減小，纖維化標(biāo)記物(COL1A1，COL3A1，CTGF，TGFβ1，纖連蛋白和α-SMA)和肥厚性胎兒基因(ANP，BN

9、P，β-MHC，ACTA1和IL-6)的表達(dá)在PHF8-Tg小鼠也顯著下調(diào)，這些結(jié)果表明，PHF8可抑制壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的病理性心肌重構(gòu)。
　　3.PHF8調(diào)節(jié)NRMCs肥厚性生長(zhǎng):
　　PHF8過(guò)表達(dá)可抑制PE誘導(dǎo)的肥厚性胎兒基因表達(dá)并下調(diào)其啟動(dòng)子活性，而PHF8敲除則促進(jìn)PE誘導(dǎo)的肥厚性胎兒基因表達(dá)并上調(diào)其啟動(dòng)子活性。研究結(jié)果表明，PHF8在體外負(fù)向調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)。
　　4.PHF8調(diào)節(jié)AKT-mTOR信號(hào)通路:

10、
　　PHF8過(guò)表達(dá)顯著降低TAC誘導(dǎo)的Akt和mTOR的磷酸化，這表明PHF8過(guò)表達(dá)阻斷TAC誘導(dǎo)的Akt-mTOR信號(hào)通路。敲除PHF8則促進(jìn)了PE誘導(dǎo)的AKT-mTOR途徑的激活。
　　5.雷帕霉素可修復(fù)PHF8表型缺失:
　　我們發(fā)現(xiàn)雷帕霉素抑制PE誘導(dǎo)的NRCMs肥大性生長(zhǎng)，也抑制PE誘導(dǎo)的ANP和β-MHC的蛋白質(zhì)合成和啟動(dòng)子活化，并且PHF8敲除誘導(dǎo)的ANP和β-MHC蛋白質(zhì)合成和增生性基因表達(dá)的上調(diào)被完

11、全阻斷。因此，雷帕霉素可修復(fù)PHF8表型缺陷。
　　結(jié)論：
　　1.PHF8能抑制壓力負(fù)荷下心肌重塑及心肌細(xì)胞肥大性生長(zhǎng);
　　2.PHF8抑制心肌細(xì)胞肥大性生長(zhǎng)的作用可能是通過(guò)AKT-mTOR信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的;
　　3.PHF8可能起到類似雷帕霉素抗心肌肥厚的作用。
　　4.在本實(shí)驗(yàn)研究中，我們分別在體內(nèi)及體外水平研究了PHF8對(duì)心肌肥厚的抑制作用，并初步探討了其作用的分子生物學(xué)機(jī)制，以期為臨床防治心肌肥厚