DNA甲基化酶和組蛋白去乙?；敢种苿┲委熞认侔┑膶嶒炑芯?pdf

1、胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一,發(fā)病率和死亡率位居我國惡性腫瘤的前10位,且有逐年增高趨勢。預后極差,近50年來,盡管傳統(tǒng)的治療手段如手術、放療、化療或這些方法的聯(lián)合應用取得許多重大進展,但對胰腺癌患者的預后幾乎沒有顯著改善,胰腺癌死亡率依然近乎等于發(fā)病率。表觀遺傳學(Epigenetics)改變導致的基因表達改變是腫瘤發(fā)生的重要機制,包括DNA甲基化(DNA methylation)以及組蛋白去乙酰化(Histone Deacetyl

2、ation)等。DNA甲基化轉移酶抑制劑(DNAmcthyltransferases inhibitors,DNMTi)以及組蛋白去乙?；敢种苿?histonedeacetylase,inhibitors,HDACi)被證明在多種腫瘤中具有治療作用,可以使腫瘤中的抑癌基因重新表達,誘導細胞分化、抑制生長,誘導凋亡等,但其具體的分子作用機制仍不清楚。 本課題旨在探討DNA甲基化轉移酶抑制劑5-AZA-dC(5-aza-deoxy

3、cytidine)和組蛋白去乙?；敢种苿┣啪?trichostatin A,TSA)聯(lián)合應用對胰腺癌的治療作用。通過體外試驗探討對胰腺癌細胞增殖、凋亡和細胞周期及其相關基因的影響,同時檢測增殖和凋亡相關基因表達的變化,體內(nèi)試驗觀察對胰腺癌裸鼠移植瘤生長的抑制作用。初步探討其在治療胰腺癌的作用及其作用機制。 一、HDAC1蛋白和DNMT1蛋白在人胰腺癌組織中的表達 目的:檢測HDAC1蛋白和DNMT1蛋白在胰腺癌組織

4、和癌旁組織中的表達情況,并對其在組織中表達的一致性進行相關性分析。 材料和方法:胰腺癌組織及相應癌旁組織標本23對。采用生物素-過氧化酶(streptavidin peroxidase,SP)免疫組織化學法檢測胰腺癌和癌旁組織HDAC1蛋白和DNMT1蛋白表達,分析腫瘤組織與癌旁組織的陽性率差別；同一組織來源相鄰切片進行配對,對HDAC1蛋白及DNMT1蛋白陽性率進行相關性分析。 結果: HDAC1蛋白及DNMT1蛋白均

5、在胰腺導管細胞癌組織細胞核表達,染色為棕黃色,癌旁組織中多為陰性。胰腺癌與癌旁組織HDAC1蛋白表達陽性率分別為56.21％±10.26％和6.24％±5.28％,DNMT1蛋白表達陽性率分別為54.83％±23.33％和6.30％±10.78％,胰腺癌與癌旁組織陽性率均有極顯著性差異(P=0.00)。相關性檢驗顯示HDAC1蛋白與DNMT1蛋白表達相關系數(shù)0.713,有極顯著統(tǒng)計學差異(P=0.00)。 結論: HDAC1蛋白

6、及DNMT1蛋白在胰腺癌組織中的表達呈特異性,且其表達顯著相關,提示HDAC1及DNMT1可能共同參與了胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展。 二、TSA、5-AZA-dC對人胰腺癌細胞株增殖、凋亡和細胞周期的影響 目的:研究TSA、5-AZA-dC對體外培養(yǎng)的人胰腺癌細胞株增殖、凋亡和細胞周期的影響,觀察DNA甲基化轉移酶抑制劑與組蛋白去乙?；种苿┦欠窬哂袇f(xié)同抑制腫瘤的作用。 方法:分別以0.1、0.5、2.0μmol/L濃度

7、TSA干預胰腺癌PaTu8988細胞株24小時,0.5、2.0、10.0μmol/L濃度5-AZA-dC干預胰腺癌PaTu8988細胞株72小時后,以及2種藥物聯(lián)合治療,按照給藥濃度不同分為聯(lián)合低、中、高濃度組4組,分別給予5-AZA-dC 0.5、2.0及10μmol/L,干預48小時,最后24小時給予TSA 0.5μmol/L。采用WST-8法檢測細胞增殖變化,流式細胞術檢測細胞周期及凋亡的改變。 結果: 1.細胞增殖試驗:

8、TSA0.1、0.5、2.0μmol/組細胞存活率分別為95.11％±4.36％、77.84％±13.58％、69.78％±7.04％,與對照組相比差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)。5-AZA-dC 0.5、2.0和10.0μmol/L組細胞存活率分別為94.91％±1.51％、88.19％±3.28％、81.93％±4.89％,其中2.0和10.0μmol/L組與對照組相比差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01),三組間相比有顯著統(tǒng)計

9、學意義(P<0.05)。聯(lián)合治療低、中和高濃度組細胞存活率分別為86.69％±9.07％、72.86％±4.19％及57.20％±9.67％,與對照組比較,低濃度組有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05)而另二組均有極顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01),提示聯(lián)合治療較單獨用藥可以達到更好的治療效果。2.流式細胞術檢測細胞周期：TSA組G2/M期細胞百分率、凋亡細胞百分率均顯著高于對照組(均P<0.01),表現(xiàn)為G2/M期阻滯及細胞凋亡率增加。5-A

10、ZA-dC組G2/M及S期細胞百分率均高于對照組(P<0.05),亦表現(xiàn)為G2/M期阻滯。 結論: TSA及5-AZA-dC均能有效地抑制胰腺癌PaTu8988細胞株的增殖,TSA及5-AZA-dC均通過阻斷細胞周期停滯于G2/M期,誘導細胞凋亡。 三、TSA、5-AZA-dC對增殖、凋亡及細胞周期相關基因表達的影響 目的: TSA、5-AZA-dC干預胰腺癌細胞株出現(xiàn)細胞周期阻滯并誘導細胞凋亡,但其發(fā)生的分子機

11、制尚不清楚,通過Real-time RT-PCR檢測藥物干預前后細胞周期及凋亡相關基因及蛋白表達的改變,并檢測DNMT酶總體活性的變化,探討抑制腫瘤細胞增殖、誘導凋亡的作用機制。 材料和方法: TSA及5-AZA-dC干預胰腺癌細胞株,抽提細胞株總RNA,Real-time RT-PCR檢測細胞周期相關基因p21和Cyclin D1、凋亡相關基因Bax和Bcl-2的表達變化,Western Blot檢測蛋白表達,抽提核蛋白檢測D

12、NMT酶總體活性。 結果: 1.細胞周期相關基因改變：與對照組比較,TSA組p21表達明顯升高,Cyclin D1表達則明顯降低,有顯著性統(tǒng)計學差異(P<0.05);5-AZA-dC組p21表達升高,其中2.0μmol/L及10.0μmol/L濃度有顯著性統(tǒng)計學差異(P<0.05),Cyclin D1表達則略降低,但無顯著性統(tǒng)計學差異。Western Blot檢測相應的蛋白表達與其基因改變呈一致性。2.凋亡相關基因改變：與對照組

13、比較,TSA組Bax表達無顯著變化,Bcl-2表達則呈下降趨勢,2.0μmol/L濃度與對照組比較顯示有顯著性統(tǒng)計學差異(P<0.05);5-AZA-dC組Bax表達呈升高趨勢,但僅有10.0μmol/L有統(tǒng)計學差異(P<0.05),而:Bcl-2表達雖有降低,但無顯著性統(tǒng)計學差異。Western Blot檢測相應的蛋白表達與其基因改變呈一致性。 結論: TSA及5-AZA-dC通過上調(diào)p21和/或下調(diào)Cyclin D1基因表達

14、,導致其相關蛋白發(fā)生表達量改變,調(diào)控胰腺癌PaTu8988細胞周期,抑制細胞增殖和分化,誘導細胞凋亡,從而抑制了胰腺癌PaTu8988細胞株的生長。 四、TSA、5-AZA-dC對胰腺癌細胞裸鼠移植瘤的抑制作用 目的:評價TSA、5-AZA-dC對胰腺癌細胞裸鼠移植瘤生長的影響,探討TSA、5-AZA-dC的抗腫瘤治療價值。 方法:將人胰腺癌細胞PaTu8988接種至裸鼠背部皮下,隨機分為對照組、TSA組、5-A

15、ZA-dC組和聯(lián)合組4組,單次給藥劑量分別為PBS 0.2ml、TSAlmg/kg、5-AZA-dC 3mg/kg和TSA 1mg/kg+5-AZA-dC 3mg/kg,以腹腔注射途徑給藥,隔日1次,共5次,觀察裸鼠生命體征變化以及腫瘤大小的動態(tài)變化。實驗結束后處死裸鼠切除腫瘤標本和臟器組織,進行免疫組化和HE染色,Real-time RT-PCR檢測裸鼠移植瘤組織增殖及凋亡相關基因的表達。 結果: 1.移植瘤生長曲線顯示與對照

16、組比較,TSA與5-AZA-dC均可使腫瘤生長速度減慢,腫瘤體積在各個時間點均小于對照組,聯(lián)合治療組對腫瘤的抑制作用最為明顯,其次為TSA,各組與對照組相比差異具有顯著性(P<0.05),聯(lián)合治療組與對照組相比具有極顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)。2.細胞周期及凋亡相關基因mRNA改變：與對照組比較,TSA組p21明顯升高(P<0.01),Cyclin D1明顯降低(P<0.05),Bax無顯著變化,Bcl-2呈下降趨勢；5-AZA-d