組蛋白去乙?；敢种苿┩ㄟ^(guò)Snail誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞上皮-間質(zhì)化.pdf

1、1944年Opie等[1]在大鼠誘發(fā)肝癌的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)卵圓細(xì)胞，1956年Farber首次將其命名為卵圓細(xì)胞[2]，1958年Wilson等[3]推測(cè)卵圓細(xì)胞可能是肝臟的干細(xì)胞，隨后人們發(fā)現(xiàn)人體肝臟內(nèi)也存在卵圓細(xì)胞。目前普遍認(rèn)為肝卵圓細(xì)胞位于肝臟的匯管區(qū)、纖維隔和 Hering管周?chē)８温褕A細(xì)胞作為肝臟的成體干細(xì)胞，具有自我更新能力和多向分化的潛能，可分化成肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和腸型上皮細(xì)胞等[4]。肝卵圓細(xì)胞在肝臟受損

2、時(shí)被激活和增殖，有研究顯示肝卵圓細(xì)胞移植可修復(fù)損傷的肝臟，因此肝卵圓細(xì)胞參與了肝臟的修復(fù)、再生。由此可以推論提高肝卵圓細(xì)胞的分化和遷移能力可以提高其修復(fù)受損肝臟的能力。
　　上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是上皮細(xì)胞丟失上皮細(xì)胞表型（如上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin）并獲得間質(zhì)細(xì)胞表型（如間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin），以獲得自由移動(dòng)能力的過(guò)程；主要包括三種：1型EMT與胚胎發(fā)育、植入及器官形成相關(guān)；2型EMT與組織再生、損傷修

3、復(fù)和器官纖維化相關(guān)；3型EMT與腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移相關(guān)。肝臟內(nèi)多種細(xì)胞可發(fā)生EMT過(guò)程，包括肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和肝卵圓細(xì)胞[5]。研究顯示肝卵圓細(xì)胞的具有修復(fù)肝臟損傷作用，其發(fā)生的EMT可能有利于其修復(fù)過(guò)程。
　　組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACi)是一種新型的抗癌藥物，包括：①脂肪酸類(lèi)，包括丁酸鈉（NaBu）；②小分子氧氧肟酸鹽類(lèi)，包括二酰苯胺氧肟酸（SAHA）和曲古菌素 A（TSA）等；③親電子甲酮類(lèi)；④環(huán)形肽類(lèi)；⑤苯酰

4、胺類(lèi)；⑥其他類(lèi)化合物。最近研究顯示 HDACi可以抑制器官纖維化[6]，包括肺纖維[7]、心肌細(xì)胞纖維化[8]、腎纖維化[9]及肝纖維化等[10,11]，同時(shí)它可以通過(guò)抑制肝細(xì)胞的EMT來(lái)抑制肝纖維化，從而為治療肝硬化提供依據(jù)。
　　因此，本研究通過(guò)組蛋白去乙酰化酶抑制劑刺激肝卵圓細(xì)胞，觀(guān)察其發(fā)生EMT過(guò)程及遷移過(guò)程，探討其作用機(jī)制，以求為肝卵圓細(xì)胞修復(fù)肝臟損傷提供一種依據(jù)，同時(shí)為組蛋白去乙?；敢种苿┮种聘卫w維化提供理論依據(jù)。<

5、br>　　目的：
　　探討組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACi）誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞（WB-F344）上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和促使其遷移能力增強(qiáng)的機(jī)制。
　　方法：
　?。?）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝卵圓細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)志物OV6表達(dá)情況；
　?。?）應(yīng)用組蛋白去乙?；敢种苿⊿AHA、TSA、NaBu）處理肝卵圓細(xì)胞（WB-F344），誘導(dǎo)其發(fā)生上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，觀(guān)察其形態(tài)學(xué)變化；
　　（3）MTT方法檢測(cè)SAHA對(duì)肝卵圓細(xì)胞

6、的增殖影響情況；
　?。?）采用劃痕試驗(yàn)觀(guān)察SAHA對(duì)肝卵圓細(xì)胞遷移能力的影響；
　?。?）Western blot、熒光定量 PCR技術(shù)檢測(cè)肝卵圓細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志物 E鈣粘素（E-cadherin）和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白（Vimentin）的蛋白及mRNA變化情況；
　?。?）Western blot、熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)肝卵圓細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞-間質(zhì)化過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄因子Snail的蛋白及mRNA變化情況；
　

7、?。?）激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)肝卵圓細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞-間質(zhì)化過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄因子 Snail入核情況；
　?。?）應(yīng)用siRNA干擾Snail后，對(duì)比肝卵圓細(xì)胞SAHA刺激組及空白組的形態(tài)變化，同時(shí)Western blot檢測(cè)EMT Marker的變化。
　　結(jié)果：
　　（1）通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示在培養(yǎng)過(guò)程中WB-F344細(xì)胞干細(xì)胞性能未發(fā)生改變；
　?。?）HDACi可以誘導(dǎo)WB-F344細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)化，包括形

8、態(tài)的改變、上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin蛋白水平及mRNA水平下調(diào)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin蛋白水平及mRNA水平上調(diào)；
　?。?）劃痕試驗(yàn)顯示HDACi可以提高WB-F344細(xì)胞的遷移能力；
　　（4）在HDACi誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞EMT過(guò)程中，可以促進(jìn)EMT的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Snail的蛋白水平和mRNA水平的增加，以及促進(jìn)其核轉(zhuǎn)錄;
　?。?）siRNA干擾Snail后可以抑制HDACi誘導(dǎo)肝卵圓細(xì)胞EMT過(guò)程