基于組蛋白去甲基化酶JMJD家族探討血瘀型激素性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制.pdf

1、目的:
　　研究組蛋白去甲基化酶JMJD家族在激素性股骨頭壞死的表達(dá)及其在成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的作用。
　　方法:
　　1.手術(shù)中從4例非激素性股骨頭壞死患者（對(duì)照組）和6例血瘀型激素性股骨頭壞死患者（壞死組）的股骨近端取出骨髓。采用密度梯度離心法提取成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)，經(jīng)過(guò)純化、培養(yǎng)、傳代后，取第四代(P4)的hBMSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先進(jìn)行hBMSCs的鑒定:采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)hBMSC

2、s的表面抗原(CD105、CD29、CD73、CD44、CD34、CD45、CD11b/c)，觀察hBMSCs的成骨分化能力（堿性磷酸酶染色和茜素紅染色）和成脂分化能力（油紅染色）。然后提取總RNA，分析組蛋白去甲基化酶JMJD家族的mRNA在血瘀型激素性股骨頭壞死中的表達(dá)。
　　2.正常hBMSCs購(gòu)自Lonza，常規(guī)培養(yǎng)、傳代至P5進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。收集正常hBMSCs成骨分化第0、3、7、14、21天的細(xì)胞，提取總RNA進(jìn)行RNA-

3、seq測(cè)序分析，提取總蛋白進(jìn)行Westernblot實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建KDM4A基因沉默和基因超表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并生產(chǎn)相應(yīng)病毒，觀察沉默或超表達(dá)KDM4A后對(duì)正常hBMSCs成骨分化的影響，包括堿性磷酸酶染色、堿性磷酸酶活性檢測(cè)、茜素紅染色、RNA-seq測(cè)序分析、Westernblot實(shí)驗(yàn)等。利用JMJD家族基因廣譜抑制劑JIB-04，觀察不同濃度的JIB-04對(duì)正常hBMSCs成骨分化的影響，包括堿性磷酸酶染色、堿性磷酸酶活性檢測(cè)

4、、茜素紅染色、RNA-seq測(cè)序分析、Westernblot實(shí)驗(yàn)等。
　　結(jié)果:
　　1.從患者骨髓中提取的hBMSCs的表面抗原符合hBMSCs的特征，提取hBMSCs的形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，具備成骨分化和成脂分化的能力。
　　2.KDM6A和RUNX2基因mRNA的表達(dá)在血瘀型激素性股骨頭壞死組明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。KDM4A、KDM4B、KDM4D的mRNA表達(dá)量隨著正常hBMSCs成骨分化的

5、進(jìn)程呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)的降低，KDM4C、KDM5B、KDM5C、KDM6A、KDM6B、UTY的mRNA表達(dá)量隨著成骨分化的進(jìn)程呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)的升高。正常hBMSCs在成骨分化第0、3、7、14、21天KDM4A、KDM4B、KDM5A、KDM6B蛋白的表達(dá)隨著成骨分化時(shí)間的增加，其蛋白表達(dá)水平逐漸增加。
　　3.沉默KDM4A以后，無(wú)論是在常規(guī)培養(yǎng)基中，還是在成骨分化的培養(yǎng)基中，shKDM4A＃1、shKDM4A＃2與shNeal（對(duì)照組）相

6、比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），說(shuō)明沉默KDM4A對(duì)hBMSCs的增殖均無(wú)明顯的影響;hBMSCs在成骨分化第8天的堿性磷酸酶染色，shKDM4A＃1和shKDM4A＃2均比shNeal明顯減弱;hBMSCs在成骨分化第8天的堿性磷酸酶活性，shKDM4A＃1、shKDM4A＃2與shNeal相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。說(shuō)明沉默KDM4A后，hBMSCs成骨分化第8天的堿性磷酸酶染色和活性均受到明顯的抑制;hBM

7、SCs在成骨分化第14天的茜素紅染色，shKDM4A＃1和shKDM4A＃2均比shNeal明顯減弱，說(shuō)明沉默KDM4A后，hBMSCs成骨分化的晚期礦化受到了明顯的抑制。RNA-seq結(jié)果顯示，沉默KDM4A以后，shKDM4A＃1、shKDM4A＃2與shNeal相比較，RUNX2、SPP1(OPN)、ALP等基因的mRNA表達(dá)明顯降低，這些基因相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平也相應(yīng)的降低。
　　超表達(dá)KDM4A以后，hBMSCs在成骨分化

8、第8天的堿性磷酸酶染色，KDM4A組（野生型）和KDM4AH188A組（突變型）均比Vector組（對(duì)照組）明顯增強(qiáng);hBMSCs在成骨分化第8天的堿性磷酸酶活性，KDM4A組、KDM4AH188A組與Vector組相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。說(shuō)明超表達(dá)KDM4A后，hBMSCs成骨分化第8天的堿性磷酸酶染色和活性均明顯地升高;hBMSCs在成骨分化第14天的茜素紅染色，KDM4A組和KDM4AH188A組均比Vecto

9、r組明顯增強(qiáng)，說(shuō)明超表達(dá)KDM4A可促進(jìn)hBMSCs成骨分化的晚期礦化。Westernblot的結(jié)果顯示超表達(dá)KDM4A以后，KDM4A組、KDM4AH188A組與Vector組相比較，RUNX2和OPN蛋白的表達(dá)均升高了。
　　4.在成骨分化培養(yǎng)基中，與對(duì)照組(DMSO)相比較，800nM的JIB-04抑制hBMSCs的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05);100nM、200nM、400nM的JIB-04對(duì)hBMSCs的增殖無(wú)

10、影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。hBMSCs在成骨分化第8天的堿性磷酸酶染色，50nM、100nM、200nM、400nM、800nM的JIB-04均比對(duì)照組明顯減弱，JIB-04濃度越高，堿性磷酸酶染色越弱;hBMSCs在成骨分化第8天的堿性磷酸酶活性，50nM、100nM、200nM、400nM、800nM的JIB-04均比對(duì)照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)，JIB-04濃度越高，堿性磷酸酶活性越低。hBMS

11、Cs在成骨分化第16、19、21天的茜素紅染色，50nM、100nM、200nM、400nM、800nM的JIB-04均比對(duì)照組明顯減弱，JIB-04濃度越高，茜素紅染色越弱。RNA-seq結(jié)果顯示，100nM、400nM的JIB-04與對(duì)照組相比較，RUNX2、SPP1(OPN)、ALP等基因的mRNA表達(dá)明顯降低，RUNX2和OPN蛋白的表達(dá)水平也相應(yīng)的降低。
　　結(jié)論:
　　KDM6A可能與血瘀型激素性股骨頭壞死發(fā)病機(jī)