活血祛瘀法防治激素性股骨頭壞死塌陷的實驗與臨床研究.pdf

1、目的:
　　1.觀察兔激素性股骨頭壞死(steroid-induced osteonecrosis of femoralhead，SIONFH)模型自然修復過程中骨小梁空間結構參數(shù)的變化以及改建方式。
　　2.觀察活血祛瘀法對兔激素性股骨頭壞死修復的影響。
　　3.評價體外Micro-CT和體內(nèi)高分辨率磁共振(HRMRI)檢測動物模型骨小梁空間結構改變的一致性。
　　4.觀察藥物作用下模型壞死骨周圍組織細胞因子的

2、變化，分析活血祛瘀法對成骨-破骨偶聯(lián)的調(diào)控。
　　5.評價臨床上活血祛瘀法治療SIONFH療效，觀察骨小梁空間結構參數(shù)變化及骨小梁改建方式，剖析“活血祛瘀法”防治激素性股骨頭壞死塌陷的作用機理。
　　方法:
　　1.第一部分，評價活血祛瘀法對兔激素性股骨頭壞死修復的影響:50只健康的成年新西蘭大白兔，將其隨機分入模型組、中藥組和空白組，其中模型組和中藥組各20只，空白組10只。內(nèi)毒素(LPS)聯(lián)合甲強龍(MPS)按照L

3、PS×1(10μg/kg)耳緣靜脈注射結合MPS×6(40mg/kg)肌肉注射制作兔激素性股骨頭壞死模型。中藥組使用《醫(yī)宗金鑒》方桃紅四物湯按照兔與人等效劑量灌胃處理。分別于第2、4、8、12周行HE染色和HRMRI、Micro-CT檢測，觀察壞死及修復情況。HRMRI最小空間分辨率≤0.03mm，Micro-CT最小空間分辨率≤0.035mm，設定骨小梁成像結構參數(shù)，比較HRMRI和Micro-CT在測量股骨頭壞死骨小梁改建過程中的作

4、用。在上述相同時間點，利用Western Blot技術檢測兔股骨頭RANK、RANKL、VEGF、OPG、RUNX2、OPN、ABCB1、PPARγ蛋白表達水平。
　　2.第二部分，討論活血祛瘀法防治人股骨頭壞死塌陷的作用機理:參照《成人股骨頭壞死診療標準專家共識(2012年版)》及《股骨頭壞死診斷與治療的專家建議》的診斷標準，篩選自2011年12月～2014年10月，于廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院骨關節(jié)科就診并符合納入標準的SIO

5、NFH病例共36例64髖。其中雙側(cè)發(fā)病28例，男性20例，女性16例。年齡20～50歲，平均35歲?；颊呔驮\時出現(xiàn)關節(jié)疼痛的時間為2～24周，平均17周。簽署知情同意書，經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準后入組。每3個月行雙髖正、蛙位X線檢查，分別測量記錄股骨頭發(fā)生塌陷時間和塌陷高度。每6個月行HRMRI平掃，測量骨小梁相關空間結構參數(shù)。在治療前、服藥3個月、服藥6個月、服藥1年、服藥2年，分別記錄患者Harris評分。隨訪時間14～38個月，平

6、均為27個月?；诨颊叩腍RMRI影像資料，利用Mimics13.1醫(yī)學影像控制系統(tǒng)重建壞死區(qū)、硬化區(qū)的三維結構;利用圖像處理軟件ImageJ評價承重區(qū)冠狀面壞死面積和硬化區(qū)面積在股骨頭縱切面中的比值。通過表觀骨小梁空間結構改變，分析活血祛瘀法防治股骨頭壞死塌陷的作用機理。
　　結果:
　　1.SIONFH造模評估:40只新西蘭大白兔，中藥組(n=20)與模型組(n=20)同時注射內(nèi)毒素后，48h內(nèi)共死亡7只，33只存活，存

7、活率82.5％。模型組共14只出現(xiàn)壞死征象，壞死發(fā)生率為82.4％(14/17);中藥組5只出現(xiàn)壞死征象，壞死發(fā)生率為31.3％(5/16)。
　　2.組織學觀察:兔股骨頭切片HE染色顯示:模型組:軟骨面皺褶，骨小梁顯著較正常組稀疏，局部骨小梁斷裂，骨細胞核固縮，大量空骨陷窩形成，骨髓脂肪細胞堆積;正常組:骨小梁結構完整，空間排布規(guī)則，小梁內(nèi)的骨細胞清晰可見，空骨陷窩的數(shù)量較少，骨髓中存在豐富的造血細胞，脂肪細胞含量相對較少，且形

8、態(tài)正常;中藥組:骨小梁相較正常組稀疏，形態(tài)尚可，成骨細胞活躍。4周時模型組空骨陷窩率為(17.24±1.08)％，正常組(5.33±0.96)％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，中藥組4周時組織學觀察與模型組無明顯差異，8周及12周檢測可見成骨細胞活躍，骨小梁形態(tài)較前完整，空骨陷窩率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　3.HRMRI掃描分析:T1WI可見模型組股骨頭內(nèi)存在明顯低信號帶;中藥組在股骨頭內(nèi)近骨骺處存在小斑片

9、樣低信號改變，但大部分骨組織的灰度值正常。HRMRI結構參數(shù)分析結果顯示，模型組與正常組相比，前者的ROE值（即壞死水腫區(qū)面積）增加，ROE/NR比例升高，中藥組與模型組相比，中藥組的ROE值減少，ROE/NR的比例下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示活血祛瘀法可促進激素性股骨頭壞死修復。
　　4.Micro-CT掃描分析:在各時間節(jié)點分別取各組兔左側(cè)股骨頭行Micro-CT檢測，表觀可見模型組骨小梁較正常組稀疏，部分斷裂

10、。中藥組與模型組相比，骨質(zhì)改善，骨小梁存在局部性修復。Micro-CT檢測發(fā)現(xiàn)，模型組與正常組相比，前者BV、Conn.D.、SMI、Tb.N、Tb.Th值降低，BV/TV比例下降，BS/BV、SMI、Tb.Sp值升高。中藥組與模型組相比，前者BV、Conn.D.、SMI、Tb.N值升高，BV/TV比例增加，BS/BV、Tb.Sp、Tb.Th值下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　5.SIONFH相關蛋白檢測:Wester

11、n blot檢測RANK、RANKL、ABCB1、RUNX2、VEGF、OPN、PPARγ、OPG的蛋白表達。與模型組相比，中藥組RUNX2、OPG表達上調(diào)而RANK、RANKL表達下調(diào)（P＜0.05），而模型組相較于正常組，其RANK、RANKL、RUNX2蛋白均上調(diào)，OPG蛋白表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與模型組相比，中藥組的ABCB1蛋白表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而模型組ABCB1的蛋白表達相較正

12、常組下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;相對于正常組，模型組內(nèi)VEGF的蛋白表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。相對于模型組，中藥組VEGF的蛋白上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各組間OPN和PPARγ的蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　6.臨床病例療效評價:本研究36例患者64髖中，42髖與治療前相比，壞死水腫區(qū)面積減小(42/64)。至隨訪2年，未塌陷29髖中8髖塌陷，塌陷率27.6％(8

13、/29)，塌陷時間3個月～14個月，平均塌陷時間8.7個月。其中塌陷＜2mm者4例;2mm～4mm者3例;＞4mm者1例。治療前、服藥3個月、6個月、1年、2年Harris評分分別為:81.5±10.8、83.7±9.1、87.3±4.7、87.5±7.8、79.4±5.2。其中服藥6個月、1年與服藥前相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　7.三維重建MRI表現(xiàn)與臨床癥狀相關性分析:股骨頭壞死中壞死體積、壞死病灶總表面積、壞

14、死體積比、承重壞死區(qū)面積與Harris評分呈負相關(r=0.171，P＜0.05; r=0.288，P＜0.05; r=0.452，P＜0.01; r=0.452，P＜0.01)。硬化區(qū)體積、承重硬化區(qū)面積與Harris評分呈正相關（r=-0.321，P＜0.01; r=0.452，P＜0.01）。
　　結論:
　　1.活血祛瘀法治療兔SIONFH后，HRMRI及Micro-CT顯示，兔股骨頭內(nèi)壞死骨小梁結構改建優(yōu)于自然修復

15、，說明活血祛瘀法能夠改善SIONFH影像學表現(xiàn)。病理切片HE染色顯示，在12周結束時3組病理改變差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明活血祛瘀法能夠促進兔SIONFH修復，12周時趨于修復完全。
　　2.2周時HRMRI即出現(xiàn)壞死征象，并經(jīng)過病理驗證壞死發(fā)生，同期Micro-CT未出現(xiàn)骨小梁形態(tài)及骨密度明顯改變。實驗表明，HRMRI與Micro-CT作為高分辨率影像技術均能有效評價活血祛瘀法治療兔SIONFH療效，但HRMRI對股

16、骨頭壞死診斷要早于Micro-CT，與臨床實踐相符合。
　　3.Micro CT顯示，中藥組相較于模型組BV、Conn.D.、SMI、Tb.N值升高，BS/BV、Tb.Sp值降低，但Tb.Th值下降。說明活血祛瘀法治療可增高骨密度，促進修復，但未能使骨量明顯增加。
　　4.中藥組相較于模型組，除RANK、RANKL表達水平下調(diào)外，其余均為上調(diào);而模型組與正常組相比，RANK、RANKL、RUNX2的蛋白表達上調(diào)，OPG、AB

17、CB1、VEGF的蛋白表達下調(diào)。說明活血祛瘀法促進壞死修復的機制可能與抑制RANK、RANKL表達，促進ABCB1、OPG、VEGF、RUNX2表達有關。
　　5.“活血祛瘀法”可改善未塌陷SIONFH患者Harris評分，維持髖關節(jié)基本功能。同時三維重建MRI表現(xiàn)與臨床癥狀相關性分析顯示:股骨頭壞死中壞死體積、壞死病灶總表面積、壞死體積比、承重壞死區(qū)面積與Harris評分呈負相關;硬化區(qū)體積、承重硬化區(qū)面積與Harris評分呈正