組蛋白甲基化酶Suv39h1調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞分化的表觀遺傳機(jī)制研究.pdf

1、肌肉細(xì)胞分化是發(fā)育生物學(xué)的重要課題。肌肉細(xì)胞分化具有很復(fù)雜的分子機(jī)制，涉及到了多個(gè)肌肉相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控家族因子、信號(hào)通路的作用。肌肉調(diào)節(jié)因子家族MRFs(MRFs)和肌肉增強(qiáng)子2(MEF2)家族因子在肌肉分化過程中起著決定性的調(diào)控作用。而近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)表明組蛋白修飾酶也參與到肌肉細(xì)胞分化調(diào)控機(jī)制中并發(fā)揮了重要作用。然而目前的研究主要圍繞在組蛋白修飾酶與MyoD的相互作用，對(duì)于組蛋白修飾酶與MyoD下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在肌細(xì)胞分化進(jìn)程中是

2、何關(guān)系的研究很少。
　　本研究在研究豬組蛋白甲基化酶Suv39h1基因在豬體內(nèi)的表達(dá)模式的基礎(chǔ)上;初步分析豬組蛋白甲基化酶Suv39h1在豬肌衛(wèi)星細(xì)胞中的生物學(xué)功能;并利用小鼠C2C12成肌細(xì)胞闡明組蛋白甲基化酶Suv39h1通過對(duì)MEF2的作用影響肌肉分化的機(jī)制。本研究對(duì)于深入了解肌肉細(xì)胞分化機(jī)制具有重要的理論價(jià)值。結(jié)果如下:
　　1.豬組蛋白甲基化酶Suv39h1基因及其輔助子異染色質(zhì)蛋白HP1基因的克隆
　　通過

3、電子克隆技術(shù)、RT-PCR方法，從3月齡梅山豬背最長(zhǎng)肌RNA模板中克隆分離出Suv39h1和HP1基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示豬組蛋白甲基化酶Suv39h1及其輔助子異染色質(zhì)蛋白HP1(HP1)具有典型的保守結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu):Suv39h1具有典型的Suv39h家族蛋白結(jié)構(gòu)域:chromo domain和SET domain。HP1具有典型的異染色質(zhì)蛋白家族的典型蛋白結(jié)構(gòu):chomo domain和chromo shadow doma

4、in。
　　2.組蛋白甲基化酶Suv39h1在梅山豬組織表達(dá)模式分析
　　分別通過半定量和定量PCR方法分子Suv39h1在梅山豬組織表達(dá)模式。表達(dá)模式結(jié)果表明:Suv39h1在生后90天梅山豬的心、肝、脾、肺、腎、大腦、小腦、咬肌、直腸、半腱肌、肩脂、背脂、比目魚肌、背最長(zhǎng)肌、股二頭肌組織中均有表達(dá)。Suv39h1在胚胎65天，出生后3天、35天、90天、150天及180天的最長(zhǎng)肌、咬肌、半腱肌和股二頭肌中的表達(dá)沒有明顯變

5、化。
　　3.組蛋白甲基化酶Suv39h1在豬肌衛(wèi)星細(xì)胞中的調(diào)控作用分析
　　在豬肌衛(wèi)星細(xì)胞中超表達(dá)或干擾Suv39h1，培養(yǎng)細(xì)胞48h進(jìn)行流式分析，檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)Suv39h1能夠抑制豬肌衛(wèi)星細(xì)胞在S期的DNA合成，使細(xì)胞滯留在G0/G1期。EdU標(biāo)記超表達(dá)Suv39h1的肌衛(wèi)星細(xì)胞同樣表明超表達(dá)Suv39h1能夠減少豬肌衛(wèi)星細(xì)胞在S期的細(xì)胞數(shù)量。2％馬血清分化超表達(dá)或干擾Suv39h1處理的肌衛(wèi)星細(xì)胞8天

6、，免疫染色肌細(xì)胞分化晚期標(biāo)志蛋白MyHC。免疫熒光結(jié)果表明，豬肌衛(wèi)星超表達(dá)或干擾Suv39h1，細(xì)胞顯示MyHC的數(shù)量明顯少于對(duì)照組。
　　4.組蛋白甲基化酶Suv39h1影響成肌細(xì)胞分化的機(jī)制
　　(1)組蛋白甲基化酶Suv39h1對(duì)成肌細(xì)胞增殖的影響
　　在C2C12細(xì)胞中超表達(dá)或干擾Suv39h1，培養(yǎng)細(xì)胞48h進(jìn)行流式分析，檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)Suv39h1能夠抑制C2C12細(xì)胞在S期的DNA合成，使

7、細(xì)胞滯留在G0/G1期。而干擾Suv39h1能夠提高C2C12細(xì)胞在G2/M期的數(shù)量。EdU標(biāo)記超表達(dá)Suv39h1的C2C12細(xì)胞同樣表明超表達(dá)Suv39h1能夠減少C2C12細(xì)胞在S期的細(xì)胞數(shù)量。
　　(2)組蛋白甲基化酶Suv39h1對(duì)成肌細(xì)胞分化的影響
　　2％馬血清分化超表達(dá)或干擾Suv39h1處理的C2C12細(xì)胞8天，免疫染色肌細(xì)胞分化晚期標(biāo)志蛋白MyHC。免疫熒光結(jié)果表明，C2C12細(xì)胞超表達(dá)或干擾Suv39h

8、1，細(xì)胞顯示MyHC的數(shù)量明顯少于對(duì)照組。在C2C12細(xì)胞中超表達(dá)或干擾Suv39h1，生長(zhǎng)培養(yǎng)以及2％馬血清分別分化培養(yǎng)2天、4天、6天，通過定量PCR方法分析C2C12細(xì)胞分化過程中的分化早晚期標(biāo)志基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，超表達(dá)Suv39h1的C2C12細(xì)胞和干擾Suv39h1的C2C12細(xì)胞中My f5的表達(dá)趨勢(shì)完全相反。超表達(dá)Suv39h1的C2C12細(xì)胞隨著分化時(shí)間的增加，My f5的表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)，而干擾Suv39h1的C2

9、C12細(xì)胞隨著分化時(shí)間的增加，My f5的表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)。在超表達(dá)或干擾Suv39h1的C2C12細(xì)胞細(xì)胞隨著分化時(shí)間的增加，Mef2c和MyHC的表達(dá)趨勢(shì)同對(duì)照組相比沒有明顯變化。
　　(3)組蛋白甲基化酶Suv39h1通過與MEF2C作用抑制MEF2C下游靶基因轉(zhuǎn)錄激活
　　2％馬血清分別分化處理C2C12細(xì)胞0天、2天、4天和6天，免疫染色Suv39h1，HP1和MEF2C在細(xì)胞中的定位情況。結(jié)果顯示:隨著C2C12細(xì)胞

10、分化天數(shù)的增加，Suv39h1，HP1和MEF2C在細(xì)胞中一直存在于細(xì)胞核內(nèi)。哺乳動(dòng)物雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Suv39h1與MEF2C之間的相互作用存在于未分化的C2C12細(xì)胞，在分化的C2C12細(xì)胞中二者不存在相互作用。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)Suv39h1與MEF2C在未分化的C2C12細(xì)胞中存在相互作用。MEF2報(bào)告系統(tǒng)分析結(jié)果表明:Suv39h1能夠抑制MEF2C下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。
　　(4) HP1抑制Mef2c的轉(zhuǎn)錄激

11、活
　　超表達(dá)HP1顯著降低Mef2c啟動(dòng)子活性和Mef2c在C2C12細(xì)胞的表達(dá)。綜上所述，本研究的結(jié)論是:
　　組蛋白甲基化酶Suv39h1參與豬肌衛(wèi)星細(xì)胞和C2C12細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控。超表達(dá)Suv39h1能夠抑制豬肌衛(wèi)星細(xì)胞和C2C12細(xì)胞分化。Suv39h1與MEF2C之間的相互作用存在于未分化的C2C12細(xì)胞，二者能夠在未分化的C2C12細(xì)胞中形成Suv39h1-MEF2C復(fù)合體，并且Suv39h1協(xié)同HP1能顯