PRMT1通過(guò)對(duì)MyoD精氨酸甲基化修飾調(diào)控成肌細(xì)胞分化.pdf

1、表觀(guān)遺傳學(xué)是指在基因的DNA序列不發(fā)生改變的情況下，基因的表達(dá)水平與功能發(fā)生改變，并產(chǎn)?？蛇z傳的表型組，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑、RNA介導(dǎo)的調(diào)控。組蛋白修飾是表觀(guān)遺傳學(xué)中很重要的調(diào)控方式。包括組蛋白的甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等，它對(duì)基因的激活和抑制起著重要作用。
　　 MyoD是堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)家族的一個(gè)重要蛋白，在肌肉分化過(guò)程中起關(guān)鍵作用。

2、我們以低血清誘導(dǎo)小鼠C2C12細(xì)胞作為肌肉分化的模型，并對(duì)其分化機(jī)制以及分化過(guò)程中早期分化標(biāo)志—myogenin基因啟動(dòng)予區(qū)轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子的結(jié)合進(jìn)行研究，特別是精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶修飾對(duì)myogenin基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。
　　 C2C12細(xì)胞，主要呈三角形和紡錘形，少數(shù)多邊形；而低血清誘導(dǎo)處理后，C2C12細(xì)胞逐漸呈現(xiàn)典型的分化形態(tài)，如胞體伸長(zhǎng)，出現(xiàn)多核肌纖維類(lèi)似結(jié)構(gòu)并整齊排列等。我們利用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑AdOx處理C2C12細(xì)胞后發(fā)

3、現(xiàn)，C2C12細(xì)胞的分化受到抑制。包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)上不能出現(xiàn)多核肌纖維類(lèi)似結(jié)構(gòu)，分化標(biāo)志myogenin的蛋白水平及mRNA水平的抑制。而組蛋白修飾酶PRMT1、PCAF及CARM1的蛋白質(zhì)水平在藥物處理前后變化不明顯。表明甲基化修飾可能是肌肉分化過(guò)程中的必需過(guò)程。
　　 雙熒光素酶報(bào)告基因分析發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染的各PRMT家族成員中，PRMT1和CARM1顯著地增強(qiáng)myogenin基因啟動(dòng)子活性。我們進(jìn)一步共轉(zhuǎn)染組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶PC

4、AF、當(dāng)PRMT1與CARM1及PCAF共轉(zhuǎn)染時(shí)，比單獨(dú)轉(zhuǎn)染三者任何一個(gè)，或二二組合，激活效應(yīng)更明顯。說(shuō)明PRMT1可與CARM1及PCAF協(xié)同激活MyoD介導(dǎo)的myogenin基因啟動(dòng)子活性。PRMT1是肌肉分化主導(dǎo)開(kāi)關(guān)(master switch)MyoD的轉(zhuǎn)錄共激活子。
　　 染色質(zhì)免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)分析是近些年發(fā)展起來(lái)檢測(cè)蛋白因予在體內(nèi)與染色質(zhì)的結(jié)合，進(jìn)而為蛋

5、白因子參與染色質(zhì)水平基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供證據(jù)的方法。本研究運(yùn)用該方法，檢測(cè)了低血清誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞分化過(guò)程中，肌細(xì)胞分化決定因子MyoD、乙酰轉(zhuǎn)移酶PCAF與精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶CARM1及PRMT1在myogenin基因啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)的結(jié)合情況。這些轉(zhuǎn)錄岡子在誘導(dǎo)3h后即可結(jié)合到染色質(zhì)。
　　 GST-pulldown實(shí)驗(yàn)顯示，MyoD與PRMT1共存于一個(gè)復(fù)合物中。我們進(jìn)一步確定了MyoD的氨基端及bHLH結(jié)構(gòu)域與PRMT1相互

6、作用，而MyoD的羧基端(MyoD162-318)則不能與PRMT1相互作用。將MyoD亞克隆至pEGFP-C1表達(dá)綠色熒光蛋白標(biāo)簽的融合蛋白，將PRMT1克隆至pmCherry-C1載體表達(dá)帶紅色熒光蛋白標(biāo)簽的融合蛋白。將GFP融合的MyoD與Cherry融合的PRMT1共轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞,48h后用激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀(guān)察。我們發(fā)現(xiàn)，GFP-MyoD主要定位于核內(nèi)，而Cherry-PRMT1則在整個(gè)細(xì)胞廣泛分布，將二者熒光融合