CpG島甲基化對(duì)C-EBP β基因表達(dá)和脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控作用.pdf

1、肥胖、Ⅱ型糖尿病、心腦血管疾病和腫瘤等存在密切的相關(guān)性，研發(fā)防治肥胖及其相關(guān)疾病的藥物均是重要的研究課題。
　　C/EBPβ在前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞過程中起關(guān)鍵作用，C/EBPβ基因表達(dá)激活C/EBPα，后者激活多個(gè)參與脂肪合成的酶系基因（如422/ap2，SCD1，GLU4等）的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)脂肪合成，使前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。
　　首先用軟件分析發(fā)現(xiàn)C/EBP基因啟動(dòng)子序列富含CpG島，推測(cè)CpG島的甲基化調(diào)控C/E

2、BPβ基因的表達(dá)，在前脂肪細(xì)胞未加入誘導(dǎo)劑時(shí)，其啟動(dòng)子CpG島處于高度甲基化，導(dǎo)致C/EBPβ基因表達(dá)呈沉默狀態(tài);加入誘導(dǎo)劑MDI后，C/EBPβ啟動(dòng)子區(qū)域CpG島去甲基化，使C/EBPβ基因表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性，誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。在具體C/EBPβ基因啟動(dòng)區(qū)域CpG島甲基化狀態(tài)檢測(cè)和Western Blot分析中，觀察到這種相關(guān)性。顯示C/EBPβ基因啟動(dòng)區(qū)域CpG島的甲基化狀態(tài)調(diào)控C/EBPβ基因表達(dá)，在調(diào)控前脂肪細(xì)胞分化為脂肪

3、細(xì)胞過程中起重要作用。
　　在第一個(gè)去甲基位點(diǎn)前發(fā)現(xiàn)一個(gè)潛在的GATA-2蛋白結(jié)合位點(diǎn)，通過不同的時(shí)效曲線也觀察到GATA-2和C/EBPβ表達(dá)存在負(fù)相關(guān)，說明GATA-2一定程度上調(diào)控C/EBPβ的表達(dá)。進(jìn)一步用Molecular Dock計(jì)算機(jī)對(duì)接軟件得出:GATA-2蛋白可以結(jié)合到C/EBPβ基因啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)。
　　地黃具有較高的藥用價(jià)值，為四大淮藥之一。我們的研究表明，地黃提取液能抑制脂肪細(xì)胞分化和降低飲食性肥

4、胖大鼠的高血糖和高血脂。同時(shí)地黃提取液可以在6天的時(shí)候較大程度抑制C/EBPβ蛋白的表達(dá)，但在24小時(shí)并沒有明顯地抑制其表達(dá)，說明地黃提取液可能不是通過抑制C/EBPβ基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG去甲基化，從而使得C/EBPβ基因表達(dá)降低;但是RE可以顯著提高GATA-2在前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)后1-4天時(shí)的表達(dá)水平，結(jié)合它抑制C/EBPβ基因表達(dá)的作用，推斷RE抑制前脂肪細(xì)胞分化的機(jī)理可能與GATA-2途徑有關(guān)，與黃連素的作用相似。
　　1、C

5、/EBPβ基因表達(dá)水平的檢測(cè)
　　為通過Western Blot的方法檢測(cè)C/EBPβ的表達(dá)水平，我們制備C/EBPβ的抗血清。首先克隆C/EBPβ的cDNA基因片段，與Ply4載體重組，經(jīng)溫度誘導(dǎo)，表達(dá)產(chǎn)物大部分形成包涵體，經(jīng)初步純化后作為抗原免疫家兔制備C/EBPβ的抗血清。抗血清對(duì)C/EBPβ蛋白有識(shí)別作用。
　　用此抗血清檢測(cè)前脂肪細(xì)胞分化過程中不同時(shí)間點(diǎn)C/EBPβ的表達(dá)水平，結(jié)果顯示:C/EBPβ的在加入誘導(dǎo)劑后

6、即開始表達(dá)，在1天時(shí)表達(dá)水平達(dá)到最高，從而引起C/EBPα蛋白的表達(dá)，促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化。在誘導(dǎo)24小時(shí)后C/EBPβ表達(dá)量逐步降低。
　　2、前脂肪細(xì)胞分化與G/EBPβ基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化的關(guān)系
　　用軟件分析C/EBPβ的基因序列時(shí)發(fā)現(xiàn)，該基因啟動(dòng)位點(diǎn)ATG之前約-3000bp富含GC，存在多個(gè)CpG島。傳統(tǒng)理論認(rèn)為CpG島中C的甲基化狀態(tài)影響下游基因表達(dá)，甲基化程度越高，下游基因表達(dá)水平越低，反之，基因表達(dá)水平

7、越高。
　　采用BSP-PCR方法檢測(cè)前脂肪細(xì)胞分化前后該段序列的CpG島甲基化狀態(tài)變化情況，亞硫酸鹽測(cè)序法將DNA分子中的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(T)，然后經(jīng)PCR擴(kuò)增基因片段并檢測(cè)基因順序變化的情況，分析基因位點(diǎn)是否存甲基化。結(jié)果顯示:前脂肪細(xì)胞分化前后72小時(shí)內(nèi)C/EBPβ基因表達(dá)變化是在誘導(dǎo)后24小時(shí)C/EBPβ基因表達(dá)水平最高，然后逐步降低，所以檢測(cè)C/EBPβ基因啟動(dòng)子在24小時(shí)的甲基化情況，結(jié)果表明在24小時(shí):C/

8、EBPβ基因啟動(dòng)區(qū)域共有7個(gè)CpG位點(diǎn)呈甲基化狀態(tài)，其中的2個(gè)甲基化位點(diǎn)在加入誘導(dǎo)劑后發(fā)生去甲基化現(xiàn)象，同時(shí)C/EBPβ基因從沉默到高水平表達(dá)，表明CpG島去甲基化在調(diào)控C/EBPβ基因表達(dá)以及前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過程中起重要作用。
　　在前脂肪細(xì)胞(3T3-L1 cells)分化前后加入5一氮雜-2一脫氧胞苷(AZA，又名地西他濱decitabine)觀察其對(duì)C/EBPβ基因表達(dá)的影響。AZA是阿扎胞苷脫氧核糖類似物，甲基化轉(zhuǎn)移

9、酶的抑制劑。結(jié)果顯示:AZA并沒有提高C/EBPβ基因表達(dá)量，相反卻降低其表達(dá)，表明C/EBPβ基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化可能是保守存在的，而不是通過甲基化轉(zhuǎn)移酶修飾而成的，而AZA可能具有去甲基化作用，但由于有多種去甲基化的途徑，AZA具體作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。
　　在分析C/EBPβ基因啟動(dòng)子CpG島順序時(shí)發(fā)現(xiàn)，其中的一個(gè)甲基化位點(diǎn)上游有轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子GATA-2序列結(jié)合位點(diǎn)，該甲基化位點(diǎn)在誘導(dǎo)后發(fā)生去甲基化現(xiàn)象，所以檢測(cè)

10、GATA-2和C/EBPβ蛋白在前脂肪細(xì)胞的分化前后的變化，結(jié)果表明兩者存在負(fù)相關(guān)，即在加入誘導(dǎo)劑后GATA-2表達(dá)量迅速降低，而C/EBPβ蛋白立即大量表達(dá)。通過計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接發(fā)現(xiàn)GATA-2蛋白可以結(jié)合到C/EBPβ基因啟動(dòng)子的甲基化位點(diǎn)，當(dāng)GATA-2蛋白結(jié)合到該甲基化位點(diǎn)時(shí)，阻止該位點(diǎn)發(fā)生去甲基化，加入誘導(dǎo)劑后，GATA-2蛋白表達(dá)量迅速降低，該甲基化位點(diǎn)失去保護(hù)作用而去甲基化，從而C/EBPβ蛋白開始表達(dá)。
　　3、生地

11、黃提取液對(duì)大鼠飲食性肥胖的抑制作用及其對(duì)前脂肪細(xì)胞分化過程中C/EBPβ基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化的影響
　　采用高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)技術(shù)，通過在反相C18色譜柱上進(jìn)行分離和在線檢測(cè)對(duì)應(yīng)色譜峰的分子量，將地黃提取物分段收集得Hx～H17共18個(gè)組分，只有Hx組分顯著抑制前脂肪細(xì)胞分化，但只有整個(gè)地黃提取液(RE)的50％，可能是因?yàn)榈攸S中Hx與其他組分存在協(xié)同作用。用3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化模型和高脂飲食誘導(dǎo)

12、幼年肥胖大鼠模型研究生地黃提取液對(duì)脂肪細(xì)胞分化和飲食性肥胖的抑制作用，Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示生地黃提取液抑制脂肪細(xì)胞分化過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ的表達(dá)。生地黃提取液對(duì)幼年大鼠飲食性肥胖的研究結(jié)果顯示:體重、體重指數(shù)和脂肪組織的重量降低，并有降脂和降血糖等作用。
　　分析生地黃提取液對(duì)前脂肪細(xì)胞分化過程中C/EBPβ啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化狀態(tài)的影響，研究結(jié)果顯示:地黃提取液(2mg/ml)與前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化劑同

13、時(shí)加入24小時(shí)后，C/EBPβ基因表達(dá)水平?jīng)]有明顯下降，但是在4天時(shí)C/EBPβ基因表達(dá)下降，地黃提取液可能通過C/EBPβ基因啟動(dòng)區(qū)域CpG島去甲基化以外的途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)C/EBPβ基因表達(dá)和前脂肪細(xì)胞分化的抑制作用。
　　同時(shí)在分析生地黃提取液RE對(duì)GATA-2基因表達(dá)的水平的影響時(shí)，結(jié)果顯示:RE可以顯著提高1-4天時(shí)GATA-2蛋白的表達(dá)水平，根據(jù)GATA-2具有抑制C/EBPβ基因表達(dá)的作用，推斷RE抑制前脂肪細(xì)胞分化的機(jī)理