雞脂肪分化轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和C-EBPα抗體制備及功能研究.pdf

1、脂肪細(xì)胞分化是由分化轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的復(fù)雜過程。過氧化物酶體增殖物激活受體家族(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族(CCAAT/enhance binding proteins，C/EBPs)等轉(zhuǎn)錄因子在脂肪細(xì)胞的分化過程中發(fā)揮著重要的功能。為了探討PPARγ和C/EBPa基因及其產(chǎn)物對(duì)肉雞腹脂含量的影響，本研究采用主動(dòng)免疫策略，制備了雞PPAR

2、γ和C/EBPa的抗血清；通過PPARγ和C/EBPa重組蛋白主動(dòng)免疫，觀察其對(duì)肉雞腹脂含量的影響。結(jié)果表明，通過主動(dòng)免疫策略，獲得了較高滴度的抗血清；PPARγ主動(dòng)免疫能顯著降低肉雞腹脂含量。主要包括以下幾部分研究?jī)?nèi)容： 1.PPARγ基因和C/EBPa基因原核、真核表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)雞PPARγ基因和C/EBPa基因cDNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，采用RT-PCR的方法擴(kuò)增雞PPARγ基因和C/EBPa基因的cDNA片段并將其分別

3、插入到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1和真核表達(dá)載體pcDNA3中；構(gòu)建了PPARγ基因和C/EBPa基因的原核和真核表達(dá)載體pGEX-4T-1/PPARγ、pcDNA3/PPARγ、pGEX-4T-1/C/EBPa、pcDNA3/C/EBPa。 2.PPARγ基因和C/EBPa基因抗血清的制備為進(jìn)一步研究PPARγ基因和C/EBPα基因的功能，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pcDNA3-PPARγ和pcDNA3-C/EBPα，免疫小鼠，EL

4、ISA和Western blot結(jié)果表明pcDNA3-PPARγ和pcDNA3-C/EBPα免疫小鼠產(chǎn)生了效價(jià)較高和特異性較強(qiáng)的抗體。本研究所構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3-PPAR γ和pcDNA3-C/EBPα為在細(xì)胞水平上研究雞PPAR γ基因和C/EBPα基因超表達(dá)提供了有力的工具。 3.PPARγ和C/EBPa融合蛋白對(duì)肉雞腹脂含量的影響利用IPTG誘導(dǎo)含有原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1/PPARγ和pGEX-4T-1

5、/C/EBPa的大腸桿菌BL21(DE3)菌株，表達(dá)GST-PPARγ和GST-C/EBPa融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物用Glutathione Sepharose 4B純化，將純化后的重組蛋白免疫肉仔雞，檢測(cè)其產(chǎn)生抗體情況及其對(duì)肉雞腹脂含量的影響。結(jié)果顯示融合蛋白GST-PPARγ在大腸桿菌胞內(nèi)主要以包涵體的形式表達(dá)，分子量大約80 kDa；融合蛋白GST-C/EBPa在大腸桿菌胞內(nèi)主要以可溶性蛋白形式表達(dá)，分子量大約62 kDa。主動(dòng)免疫肉雞