組織因子人—鼠嵌合抗體制備的研究.pdf

1、組織因子(tissue factor，TF)是相對分子量為47 kD的跨膜糖蛋白，在調(diào)節(jié)凝血功能方面有重要的作用，近年來研究發(fā)現(xiàn)TF參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展、血管生成和腫瘤生長等非凝血功能。利用TF單克隆抗體的導向性和特異性，抑制TF的活性，從而抑制腫瘤的生長。由于鼠源性抗體藥物對人類具有免疫原性，其廣泛的臨床應用受到極大限制，而采用基因工程技術對鼠源性抗體進行人源化改造是治療用抗體的重要手段。因此，本文在自行研制的抗人TF鼠源性單克

2、隆抗體的基礎上，利用基因工程抗體技術，成功構建了抗人TF人-鼠嵌合抗體基因的真核共表達質(zhì)粒。將其轉(zhuǎn)染CHO-K1細胞，篩選獲得能分泌表達TF嵌合抗體的CHO穩(wěn)定細胞株(JJ3)，經(jīng)Protein A親和層析柱純化獲得高純度的抗TF嵌合抗體，體外分析該抗體具有抗凝血活性和對K562和HL-60癌細胞生長具有明顯的抑制作用，為TF抗體治療的臨床應用奠定基礎。
　　首先利用RNA提取試劑盒，從分泌TF鼠源性抗體的雜交瘤細胞(mTA)中提

3、取總RNA，以鼠源性TF單克隆抗體重鏈可變區(qū)(VH)及輕鏈可變區(qū)(VL)基因序列設計特異性引物，采用RT-PCR獲得重鏈和輕鏈可變區(qū)目的基因。將目的基因分別與pCN40表達載體連接，構建成重組質(zhì)粒pCN40-VL-VH。經(jīng)AgeⅠ、BstBⅠ和HpaⅠ、EcoRⅠ分別對重組質(zhì)粒酶切鑒定和瓊脂糖凝膠電泳分析，兩條目的基因片段大小約為300 bp，與理論值(321 bp、351 bp)相吻合，測序分析其序列與目的基因序列一致，表明已成功構建

4、了抗人TF人-鼠嵌合抗體重組質(zhì)粒pCN40-VL-VH。
　　其次，以中國倉鼠卵巢細胞(CHO-K1)為宿主細胞，采用中量無內(nèi)毒素提取質(zhì)粒試劑盒提取重組質(zhì)粒pCN40-VL-VH，陽離子脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染CHO-K1細胞，經(jīng)G418硫酸鹽(800μg/mL)篩選，并通過有限稀釋法克隆化培養(yǎng)，培養(yǎng)上清經(jīng)間接ELISA檢測。對篩選的分泌抗體陽性細胞株培養(yǎng)上清經(jīng)間接ELISA、Western blot方法分析，獲得了轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCN40-

5、VL-VH的CHO細胞株(JJ3)，并能穩(wěn)定地分泌抗人TF人-鼠嵌合抗體。利用rProtein A親和層析柱純化該細胞培養(yǎng)上清中的抗體，純化后的產(chǎn)品經(jīng)紫外分光光度計定量分析抗體產(chǎn)量約為50 mg/L。經(jīng)SDS-PAGE分析:純化嵌合抗體的重鏈和輕鏈的分子量分別約為50 kD和26 kD，純度達到97％以上。
　　最后，選擇K562、HL-60、LOVO、BEL-7402人腫瘤細胞株，采用MTT法，體外研究了該純化抗體對腫瘤細胞增殖

6、的影響。結果表明:在一定濃度范圍內(nèi)，該抗體能夠明顯地抑制K562和HL-60細胞的生長，最大抑制率分別為35％和64.9％，且呈劑量效應關系，而對LOVO和BEL-7402細胞生長沒有明顯的影響。不同濃度的嵌合抗體與27.4μg/mL的TF溫育1.5h，經(jīng)脂化和凝血酶原時間測定，表明隨著嵌合抗體濃度的升高，與對照組相比，正常人血漿的PT顯著延長(P＜0.01)。
　　上述結果表明:本研究構建了抗人TF人-鼠嵌合抗體重組質(zhì)粒pCN4