抗人血小板糖蛋白IIb-IIIa人-鼠嵌合抗體的研制.pdf

1、該課題的目的是從該室已經(jīng)制備的抗人血小板GPⅡb/Ⅲa單克隆抗體中篩選出與血小板特異性結(jié)合最強(qiáng)且抑制血小板聚集最顯著的一種抗體P140,進(jìn)行人源化改構(gòu),在保留鼠源可變區(qū)的同時(shí),引入人源恒定區(qū),制備抗人血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的人-鼠嵌合抗體.以期成為用于臨床治療心腦血管疾病以及預(yù)防PCI術(shù)后"再狹窄"的有效藥物.通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)和血小板聚集抑制試驗(yàn),選取單克隆抗體P140,并從該抗體的雜交瘤細(xì)胞株(P140)中提取總RNA,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄

2、PCR得到抗體輕鏈基因和重鏈Fd段基因,以特定位點(diǎn)分別插入噬菌體抗體表達(dá)載體p3MH上,構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒p3MH/P140 κ-Fd,并在XLI-Blue菌中進(jìn)行了原核表達(dá).ELISA鑒定結(jié)果表明,表達(dá)上清中含有可溶性Fab抗體,并且能特異性地識(shí)別人血小板.進(jìn)而對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了親合層析純化.SDS-PAGE蛋白電泳、ELISA和Western blot的檢測(cè)結(jié)果證明,P140Fab抗體的分子量約47kD,是鼠源性的Fab抗體,與人血

3、小板能特異性結(jié)合,體外ADP誘導(dǎo)的血小板聚集試驗(yàn)證明,P140Fab抗體能明顯抑制血小板的聚集,并且具有劑量抑制效應(yīng).用RACE(cDNA末端的快速擴(kuò)增)的方法,獲得了完整的P140抗體重、輕鏈可變區(qū)基因,分別連接于帶有前導(dǎo)序列的真核表達(dá)載體VH、V κ上,分別構(gòu)建了重、輕鏈嵌合抗體的真核表達(dá)載體VH/CP140和V κ/CP140,共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中,進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá).RT-PCR和ELISA檢測(cè)證明,轉(zhuǎn)染后宿主細(xì)胞有人-鼠嵌合抗體基因

4、的轉(zhuǎn)錄,表達(dá)上清中含有人-鼠嵌合抗體CP140.隨后將包括前導(dǎo)序列在內(nèi)的鼠單抗P140可變區(qū)基因分別連接于不含前導(dǎo)序列真核表達(dá)載體PWS3上,構(gòu)建真核重組表達(dá)載體PWS3-P140,轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,ELISA檢測(cè)結(jié)果證明,表達(dá)上清中含有能與血小板特異性結(jié)合的人-鼠嵌和抗體,而且表達(dá)量明顯提高.結(jié)論:成功研制了一種新的功能性抗人血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的Fab抗體(P140Fab);成功構(gòu)建了抗人血小板嵌合抗體的真核表達(dá)載體并在CHO細(xì)胞中