人源抗發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒-Gn蛋白基因工程抗體的研究.pdf

1、發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(Severe fever with thrombocytopeniasyndrome virus，SFTSV)屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬，作為一種新發(fā)的病毒，人們對(duì)其感染過(guò)程以及引起的機(jī)體免疫反應(yīng)了解較少，SFTSV感染后，患者主要表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、惡心、嘔吐等胃腸道癥狀。在少數(shù)情況下，會(huì)引起意識(shí)障礙、皮膚瘀斑、消化道出血、肺出血等嚴(yán)重癥狀，并造成休克、呼吸衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)等多功能臟器衰

2、竭，最終導(dǎo)致死亡。目前，還沒(méi)有用于臨床治療的藥物，所以本研究的目的主要是為了制備人源抗發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒-Gn蛋白的基因工程抗體，一方面可以用于病毒感染的臨床檢測(cè)，另外一方面也可以用于抗體藥物的制備。
　　本研究利用噬菌體表面展示技術(shù)篩選出具有特異性以及高親和性的單克隆抗體，該技術(shù)在目前科學(xué)研究，疾病診斷以及臨床抗體藥物的制備中都有成功的先例。所謂的噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)就是將Fab或者scFv抗體基因與噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)

3、基因相互耦聯(lián)，使抗體蛋白融合表達(dá)在噬菌體外殼蛋白的N端，抗體蛋白能夠自發(fā)的折疊而呈天然蛋白狀態(tài)，并且能夠保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，有利于被靶分子識(shí)別以及與靶分子結(jié)合，通過(guò)“吸附-洗脫-擴(kuò)增”三輪富集過(guò)程，可以從噬菌體抗體庫(kù)中篩選出特異性針對(duì)抗原的單克隆抗體，并且通過(guò)各種試驗(yàn)對(duì)表達(dá)的抗體進(jìn)行功能鑒定。
　　本研究主要分兩大部分:
　　第一部分:我們分別采用SFTSV-AH12全病毒顆粒和重組表達(dá)SFTSV-Gn蛋白對(duì)人

4、源抗SFTSV Fab噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行富集篩選，分別經(jīng)過(guò)三輪的“吸附-洗脫-富集”過(guò)程，隨機(jī)各挑選了400個(gè)克隆，通過(guò)ELISA對(duì)Fab抗體的結(jié)合特異性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示通過(guò)病毒顆粒篩選，我們獲得了364株特異性針對(duì)SFTSV核蛋白的陽(yáng)性克隆，并沒(méi)有獲得特異性針對(duì)Gn蛋白的陽(yáng)性克隆;經(jīng)過(guò)包被SFTSV-Gn重組蛋白篩選，我們獲得55株與Gn蛋白特異性結(jié)合的陽(yáng)性克隆，經(jīng)序列分析，總共獲得8株唯一序列的陽(yáng)性克隆，其中5株來(lái)自Lambda庫(kù)，

5、3株來(lái)自Kappa庫(kù)。
　　第二部分:將8株Fab抗體可變區(qū)基因克隆入單質(zhì)粒/哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體HL51-14上，通過(guò)PEI轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集細(xì)胞上清獲取分泌表達(dá)的IgG全抗體，并使用Protein-A親和層析柱純化IgG抗體，分別采用ELISA、IFA和Western-blotting方法對(duì)IgG全抗體進(jìn)行功能鑒定，并通過(guò)微量中和試驗(yàn)檢測(cè)IgG抗體的中和活性。結(jié)果表明經(jīng)ELISA、IFA和Western-blo

6、tting檢測(cè)證實(shí)這8株IgG抗體均能特異性結(jié)合Gn蛋白，且針對(duì)的是線性表位，微量中和試驗(yàn)顯示8株新篩抗體沒(méi)有表現(xiàn)出中和活性。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)顯示8株IgG抗體與mAb-1C8作用于不同的抗原表位，mAb-1C8已經(jīng)證實(shí)具有中和活性，且結(jié)合的抗原表位是構(gòu)象表位。
　　綜上所述，通過(guò)病毒顆粒篩選出大量針對(duì)NP的Fab抗體，并沒(méi)有篩選得到特異性針對(duì)Gn蛋白抗體，表明NP具有強(qiáng)的免疫原性，在SFTSV感染機(jī)體免疫中發(fā)揮重要作用;通