發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒傳播機制及人源單克隆抗體研究.pdf

1、背景：
　　發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndromevirus，SFTSV)，屬布尼亞病毒科白蛉病毒屬，是一種分節(jié)段的單股負鏈RNA病毒，基因組包括L、M和S三個片段。由SFTSV感染所致的疾病稱為發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、乏力、肌肉酸痛、

2、全身不適、惡心和嘔吐等，嚴重者出現(xiàn)多器官衰竭甚至死亡。SFTS流行于東亞，包括中國、日本和韓國。SFTS的病死率高達30％，平均約12％。
　　SFTSV經(jīng)蜱叮咬傳播，也可通過接觸病人血液和分泌物感染。蜱為吸血媒介，可被其吸食血液的動物分布廣泛，但這些動物，特別是小型哺乳動物在SFTSV傳播過程中的作用尚不明確。SFTSV可能起源于中國中部淮陽山區(qū)域，但病毒在中國、日本和韓國的傳播路徑尚不清楚。目前針對該疾病，既無特效藥物，也無有

3、效的疫苗可供使用，對患者主要采取廣譜抗病毒治療和對癥支持治療。針對危重患者，中和抗體治療將是行之有效的方法。SFTS流行特征的解析、傳播模式的探討及抗體藥物的研發(fā)，對豐富SFTS的病原學(xué)知識、流行病學(xué)理論、疾病的預(yù)防控制和診斷治療具有重要意義。
　　目的：
　　通過監(jiān)測、分析自然狀態(tài)下小型宿主動物SFTSV感染狀況，探討其在SFTSV傳播過程中所起作用，為該病的預(yù)防控制提供理論依據(jù);通過對SFTSV全基因組進行遺傳進化分析，

4、探討SFTSV起源及可能傳播路徑，為SFTS的流行趨勢預(yù)測提供重要線索;研究SFTSV人源單克隆抗體，為SFTS的特效治療提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.動物標本采集及檢測
　　(1)2013年1月至8月，以山東省青島市黃島區(qū)膠南地區(qū)為調(diào)查點，捕獲宿主動物，并對宿主動物進行種屬鑒定，采集宿主動物脾臟、肝臟和心臟血標本。酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)

5、檢測心臟血SFTSV總抗體。自宿主動物脾臟提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reversedtranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR)及巢式PCR擴增SFTSV M和S片段部分基因序列，并進行序列測定。測序結(jié)果運用NCBI-BLAST與數(shù)據(jù)庫比對分析，判斷其是否為SFTSV序列，并將所得到的SFTSV序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得GenBank號碼。根據(jù)ELISA和PCR擴增結(jié)果，分

6、別計算宿主動物SFTSV抗體陽性率和SFTSV帶毒率，并綜合抗體陽性率和宿主動物帶毒率，計算宿主動物感染率。
　　(2)將所得序列與自NCBI獲得的參考株序列建立數(shù)據(jù)集，以Mega5.0軟件Clustal W程序進行比對，采用Neighbor-joining(NJ)法Kimura2-parameter distance模型，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹并進行自展信度檢驗。
　　2.SFTSV遺傳進化分析
　　(1)從NCBI Gen

7、Bank數(shù)據(jù)庫搜索并下載SFTSV病毒株序列信息，明確每株病毒標本采集時間、地點。對病毒株的L、M和S片段序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用最大似然法(Maximum Likelihood Method)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。
　　(2)利用基因重組預(yù)測軟件Recombination Detection Program version3.44(RDP3)對病毒全基因組進行初步預(yù)測，確定可能的基因重配株。結(jié)合L、M和S片段序列系統(tǒng)發(fā)育分析中病毒株

8、的分布，確定基因重配株。
　　(3)基于貝葉斯馬爾可夫鏈蒙特卡洛(Bayesian Markov chain Monte Carlo，MCMC)原理及分予鐘模型，運用軟件BEAST v1.8.0對病毒株的L、M、 S片段序列及全基因組序列進行分析，確定病毒SFTSV的進化速率、分化時間及最近共同祖先(the most recent common ancestor，TMRCA)出現(xiàn)的時間。為檢驗病毒的進化速率是否是隨機的，對序列信息

9、進行隨機化，用真實時間數(shù)據(jù)得出的進化速率和隨機化的進化速率進行比較，從而確定病毒的進化速率是否是隨機的?；诓《局嘏浜头只瘯r間對病毒傳播路徑進行分析推測。
　　3.SFTSV人源單克隆抗體制備及生物學(xué)功能研究
　　(1)利用蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測軟件預(yù)測SFTSV糖蛋白跨膜序列，確定胞外區(qū)序列。構(gòu)建包含SFTSV糖蛋白Gn和Gc胞外區(qū)的重組真核表達質(zhì)粒，并表達純化蛋白Gn、Gc。
　　(2)從病人外周血中分離單個核細胞，采用

10、流式細胞術(shù)分選針對SFTSV糖蛋白的記憶B細胞。RT-PCR、PCR擴增記憶B細胞中抗體可變區(qū)基因序列，重疊PCR法將抗體可變區(qū)與恒定區(qū)連接，構(gòu)成抗體輕、重鏈全序列。將抗體輕、重鏈全序列克隆入真核表達載體，構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒。將包含抗體輕、重鏈全序列的重組真核表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞HEK293T，利用WesternBlot初步篩選可以表達抗SFTSV Gn或Gc抗體的輕、重鏈質(zhì)粒組合。對初步篩選到的抗體，利用ELISA、間接免疫熒

11、光和空斑減少中和試驗進一步研究抗體的蛋白結(jié)合活性、病毒結(jié)合活性和中和活性。
　　結(jié)果：
　　1.捕獲動物種屬構(gòu)成及感染狀況
　　(1)2013年1～8月，在山東省青島市黃島區(qū)膠南地區(qū)，共捕獲小型哺乳動物774只，涵蓋2目3科5屬6種，包括褐家鼠（157只，20.3％）、小家鼠（183只，23.6％）、大倉鼠（135只，17.4％）、黑線姬鼠（188只，24.3％）、黑線倉鼠（18只，2.3％）及鼩鼱（93只，12.0％

12、）。戶內(nèi)捕獲嚙齒鼠類及鼩鼱376只，包括褐家鼠（151只，40.2％）、小家鼠（172只，45.7％）及鼩鼱(53只，14.1％)。野外捕獲嚙齒鼠類及鼩鼱398只，包括褐家鼠（6只，1.5％）、小家鼠（11只，2.8％）、大倉鼠（135只，33.9％）、黑線姬鼠（188只，47.2％）、黑線倉鼠（18只，4.5％）及鼩鼱（40只，10.1％）。
　　(2)捕獲的774只宿主動物中，共獲得有效心臟血標本755份，包括156份褐家鼠標

13、本、182份小家鼠標本、125份大倉鼠標本、186份黑線姬鼠標本、17份黑線倉鼠標本及89份鼩鼱標本。雙抗原夾心ELISA檢測，得到陽性標本9份，包括小家鼠標本2份、大倉鼠標本1份、黑線姬鼠標本2份、鼩鼱標本4份。宿主動物SFTSV抗體陽性率為1.2％，嚙齒鼠類、鼩鼱的抗體陽性率分別為0.8％及4.5％。鼩鼱的抗體陽性率高于嚙齒鼠類（P=0.014）。捕獲的774只宿主動物中，共獲得有效脾臟RNA標本517份，包括116份褐家鼠標本、1

14、03份小家鼠標本、83份大倉鼠標本、129份黑線姬鼠標本、9份黑線倉鼠標本及77份鼩鼱標本。經(jīng)RT-PCR、巢式PCR檢測，得到陽性標本5份，包括褐家鼠標本1份、小家鼠標本1份、大倉鼠標本1份、鼩鼱標本2份。宿主動物SFTSVRNA陽性率為1.0％，嚙齒鼠類、鼩鼱的RNA陽性率分別為0.7％及2.6％，鼩鼱的RNA陽性率略高于嚙齒鼠類，兩者之間差異并不明顯(P=0.162)。3月、6月的RNA陽性率分別為4.7％(4/86)、1.7％(

15、1/62)，其他月份未檢測到SFTSVRNA，可以認為3、6月的RNA陽性率高于其他月份(P=0.043)。2013年1～8月間，共檢測宿主動物標本755份，其中陽性標本14份，宿主動物的感染率為1.9％(14/755)，嚙齒鼠類的感染率為1.2％(8/666)，鼩鼱的感染率為6.7％(6/89)，鼩鼱的感染率高于嚙齒鼠類(P=0.003)，說明鼩鼱在SFTSV的傳播中可能起更重要作用。戶內(nèi)宿主動物感染率為2.4％(9/372)、野外宿

16、主動物感染率為1.3％(5/383)，戶內(nèi)宿主動物感染率稍高于野外，差異不明顯(P=0.291)。戶內(nèi)嚙齒鼠類感染率為1.2％(4/321)，戶內(nèi)鼩鼱感染率為9.8％(5/51)，高于嚙齒鼠類（P=0.003）;野外嚙齒鼠類感染率為1.2％(4/345)，野外鼩鼱感染率為2.6％(1/38)，稍高于野外嚙齒鼠類，差異不明顯（P=0.474）。嚙齒鼠類戶內(nèi)、野外感染率基本無差別，而鼩鼱?wèi)魞?nèi)感染率明顯高于野外（P=0.001），說明戶內(nèi)鼩鼱

17、在SFTSV傳播過程中起重要作用。
　　2.遺傳進化分析
　　(1)從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中，我們得到符合條件的SFTSV病毒株122株，這些病毒株的時間跨度為2010年至2014年。122株病毒中，108株來自中國、8株來自日本、6株來自韓國。系統(tǒng)進化分析顯示，122株病毒被分成5個主要分支，分別標記為A、B、C、D和E。
　　(2)軟件RDP4分析顯示，共14株病毒可能為基因重配株，結(jié)合系統(tǒng)進化分析判斷，

18、6株病毒為基因重配株。LN2012-14、LN2012-34、LN2012-41和LN2012-42的基因組成形式為DAD，LN2012-58為DAA，AHL為EBD。
　　(3)L片段、M片段、S片段、全基因組平均進化速率各不相同。L片段的進化速率為4.16 E-4 s/s/y(substitutions per site peryear)(95％ HPD=8.99 E-5-9.72 E-4 s/s/y），M片段的進化速率為6.

19、76 E-4 s/s/y(95％ HPD=3.92E-4-1.00 E-3 s/s/y)，S片段的進化速率為1.09E-3 s/s/y(95％ HPD=5.43E-4-1.60 E-3 s/s/y)，全基因組平均進化速率為6.73 E-4 s/s/y(95％ HPD=2.35E-4-1.09 E-3 s/s/y)。SFTSV起源于中國中部淮陽山區(qū)域，大約42年前病毒開始沿不同方向分化;約37年前，病毒從河南傳播到山東;約33年前，病毒從

20、江蘇傳播到遼寧;約31年前，病毒傳播到浙江舟山群島、日本及韓國南部濟州島。
　　3.人源單克隆抗體制備及其生物學(xué)活性研究
　　(1)成功構(gòu)建表達SFTSV Gn和Gc胞外段蛋白的重組真核表達質(zhì)粒pCAGGS-SP-Gn-StrepⅡ和pCAGGS-SP-Gc-StrepⅡ，通過哺乳動物細胞表達，并純化Gn和Gc蛋白。細胞上清中，Gn以二聚體、多聚體的形式存在，Gc大部分以單體的形式存在，小部分以二聚體的形式存在。
　　

21、(2)利用Western Blot初步篩選出可以表達抗體的輕、重鏈質(zhì)粒組合7組，表達的抗體分別標記為Ab03、Ab05、Ab52、Ab62、Ab63、Ab64和Ab71。除抗體Ab03外其他6株抗體都可以與SFTSV糖蛋白Gn結(jié)合;抗體Ab05、Ab63和Ab71能與病毒結(jié)合，而抗體Ab03、Ab52、Ab62和Ab64不能與病毒結(jié)合;無抗體有中和活性。
　　結(jié)論：
　　1.自然狀態(tài)下，鼠類及食蟲目動物鼩鼱小型哺乳動物可感染

22、并攜帶SFTSV，可能是SFTSV的儲存宿主，可能在病毒的傳播中起重要作用。與鼠類相比，鼩鼱可能在SFTSV的擴散過程中發(fā)揮更重要作用。
　　2.SFTSV進化速率相對較低，基因突變在進化過程中起到純化作用;基因重配發(fā)生率較高，可能是SFTSV進化的主要動力。SFTSV可能源于中國中部淮陽山區(qū)域，然后傳播至中國東部、東北部地區(qū)及日本、韓國。
　　3.在pH為8.0的條件下，SFTSV糖蛋白Gn以聚體的形式存在，而糖蛋白Gc大