山東省沂源縣新型布尼亞病毒致發(fā)熱伴血小板減少綜合征流行特征的初步研究.pdf

1、目的:
　　 研究新型布尼亞病毒(SFTSV)所致發(fā)熱伴血小板減少綜合征(SFTS)的流行病學(xué)特征，研究SFTS的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，探討SFTSV在自然界可能存在的動物宿主及傳播媒介，為發(fā)熱伴血小板減少綜合征的預(yù)防和控制提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.SFTS病人實(shí)驗(yàn)室診斷、臨床特征及其流行病學(xué)特征研究2011年6月至2011年11月，從山東省沂源縣醫(yī)院、中醫(yī)院獲得24例SFTS疑似病人急性期血清，并在3個

2、月后采集其恢復(fù)期血清，記錄病人基本資料、臨床信息和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果。提取疑似病人急性期血清RNA，自行設(shè)計(jì)三對引物(LCYY/L、MCYY/M、SCYY/S)用巢式RT-PCR方法分別擴(kuò)增血清中SFTSV RNA的L、M和S片段，將自行設(shè)計(jì)的三對引物與參考文獻(xiàn)的三對引物(LW/LN、MWMN、SW/SN)的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行比較，計(jì)算不同引物擴(kuò)增的檢出率。基因克隆后進(jìn)行DNA測序，同時ELISA方法檢測病人急性期和恢復(fù)期血清SFTSV總抗體。根

3、據(jù)國家衛(wèi)生部頒布《發(fā)熱伴血小板減少綜合征防治指南（2010版）》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行SFTS病例確診。研究SFTS確診病人的流行病學(xué)特征和臨床特征，以及SFTSV RNA檢出率與病人血清采集時間的關(guān)系。
　　 2.健康人群血清中SFTSV血清流行病學(xué)調(diào)查采用問卷方式在山東省沂源縣SFTS發(fā)病率較高的鄉(xiāng)鎮(zhèn)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，同時采集健康人血清。采用ELISA方法檢測健康人血清中SFTSV總抗體，計(jì)算健康人群中SFTSV抗體陽性率。

4、>　　 3.羊血清SFTSV抗體、RNA檢測及病毒分離2011年6月在山東省沂源縣SFTS發(fā)病率較高的鄉(xiāng)鎮(zhèn)采集放養(yǎng)羊血清，ELISA方法檢測羊血清中SFTSV總抗體，計(jì)算羊血清中SFTSV抗體陽性率。將抗體檢測陰性的羊血清提取RNA，RT-PCR檢測血清中SFTSV RNA，同時將血清接種DH82細(xì)胞，進(jìn)行SFTSV分離培養(yǎng)，盲傳3代后，RT-PCR檢測SFTSV RNA。
　　 4.蜱、蜱卵體內(nèi)SFTSV RNA檢測及病毒分

5、離培養(yǎng)采用布旗法在SFTS流行地區(qū)草地采集游離蜱成蟲和若蟲，采用宿主動物體表逆毛撿拾法，從羊體表采集寄生蜱，按照地區(qū)、數(shù)量各自分裝并進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類鑒定;部分吸血蜱帶回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)產(chǎn)卵。提取RNA，RT-PCR檢測蜱及蜱卵中SFTSV RNA;蜱及蜱卵用無菌生理鹽水清洗后，研磨，離心，上清接種DH82細(xì)胞，盲傳3代后，RT-PCR檢測SFTSV RNA。
　　 5.野鼠體內(nèi)SFTSV RNA及抗體的檢測2011年6月～2012年11月

6、期間，在野外自然環(huán)境中采用夾（籠）夜法捕捉野鼠。每次獲取死鼠后，鑒定其種屬、性別，解剖取脾臟，潔凈濾紙吸取鼠心臟血。將鼠脾臟在冰上研磨，提取RNA后RT-PCR擴(kuò)增SFTSVRNA，并進(jìn)行序列測定，吸血的濾紙用PBS清洗后，ELISA檢測鼠血SFTSV總抗體。
　　 結(jié)果:
　　 1.SFTS實(shí)驗(yàn)室診斷24份疑似病例中，12例SFTSV RNA陽性，陽性率為50.0％(12/24)，不同引物RT-PCR擴(kuò)增SFTS病人血

7、清中SFTSV RNA的L，M，S不同片段的檢出率不同，從生物學(xué)意義上看，S片段檢出率最高，其次是L片段，未擴(kuò)出M片段。而且SCYY-F1/R1、S-F2/R2引物擴(kuò)增的陽性病例包括了其他引物擴(kuò)增的所有陽性病例，急性期血清中病毒RNA的檢出率，7天內(nèi)為64.5％，8～14天為37.5％，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;13例病人急性期血清SFTSV抗體陽性，陽性率為54.2％(13/24);21例恢復(fù)期血清中，18例SFTSV抗體

8、陽性，陽性率為85.7％(18/21)。根據(jù)SFTSV RNA及總抗體檢測結(jié)果，確診病人22例，表明發(fā)熱伴血小板減少病例中，91.7％的病例是SFTSV感染。
　　 2.SFTS病人臨床特征及其流行病學(xué)特征臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱和消化道癥狀，100％病人均有發(fā)熱癥狀，血常規(guī)檢測出現(xiàn)血小板減少和（或）白細(xì)胞減少。22例SFTS確診病人發(fā)病時間集中在5月～10月份，8月份達(dá)高峰。年齡在40～80歲，男性14名，女性8名，不同年齡組間性別

9、無顯著性差異。職業(yè)均是農(nóng)民，90.9％確診病人飼養(yǎng)家畜，27.3％確診病人有明確蜱咬史。
　　 3.本次調(diào)查了237名健康人群，年齡分布在20～89歲，年齡中位數(shù)54歲，男女比例為1∶1.6，不同年齡組間性別分布無顯著性差異，職業(yè)均是農(nóng)民，79.3％飼養(yǎng)家畜，均無明確蜱咬史。237份健康人血清中，2份抗體陽性，SFTSV總抗體陽性率為0.8％(2/237)，效價＞1∶128。
　　 4.188份羊血清中，161份SFTS

10、V抗體陽性，陽性率為85.6％(161/188)，血清效價為1∶32～1∶1024。27份SFTSV抗體陰性羊血清中SFTSV核酸檢測均為陰性，DH82細(xì)胞分離培養(yǎng)未分離到SFTSV。
　　 5.本次采集蜱均為長角血蜱，草地里共采集游離蜱成蟲450只，未檢測到SFTSV RNA;2000只蜱若蟲SFTSV核酸檢測結(jié)果均為陰性。羊體表采集的517只吸血蜱，492只羊吸血蜱中1只核酸檢測陽性，陽性率為0.20％(1/492)。25份

11、吸血蜱產(chǎn)的卵中，SFTSV核酸檢測結(jié)果均為陰性，DH82細(xì)胞分離培養(yǎng)未分離到SFTSV。
　　 6.本研究共獲得93份野鼠，其中:黑線姬鼠59只，倉鼠3只，黃胸鼠17只，褐家鼠11只，3只鼩鼱。鼠脾臟中SFTSV核酸檢測結(jié)果均為陰性，鼠血清SFTSV抗體均為陰性。
　　 結(jié)論:
　　 1.山東省沂源縣健康人群中存在SFTSV感染。在SFTS流行季節(jié)，在SFTS流行地區(qū)，臨床上出現(xiàn)發(fā)熱伴血小板減少和（或）白細(xì)胞減少