發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒糖蛋白、核蛋白真核表達載體的構(gòu)建及其生物學活性的研究.pdf

1、發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)，是一種新發(fā)出血熱性傳染病，由一種新的布尼亞病毒，簡稱SFTSV引起。SFTS每年的發(fā)病率大約是每10萬農(nóng)村人口中有5人發(fā)病，主要感染中老年人，病死率平均是12％。自2009年在中國發(fā)現(xiàn)以來，SFTSV已在韓國和日本報道，相似病毒在美國報道。SFTSV是布尼亞病毒科白蛉病毒屬的單股負鏈RNA病毒，包含L、M、S三個片

2、段，分別編碼RNA聚合酶、糖蛋白(Gn、Gc)前體、核蛋白NP和非結(jié)構(gòu)蛋白NSs。其中Gn、Gc最可能誘導中和抗體的產(chǎn)生，目前已有研究發(fā)現(xiàn)能結(jié)合M片段的單克隆抗體(MAb4-5)可以中和SFTSV;而S片段最為保守，NP最易表達，常被用來做免疫檢測用。本研究旨在構(gòu)建NP、Gn、Gc及M片段分段蛋白的真核表達載體，表達相應蛋白，從抗原性和免疫原性方面檢測NP的生物學活性，為進一步研究中和抗體做好鋪墊。
　　目的：
　　1、構(gòu)建

3、核蛋白NP，糖蛋白Gn、Gc真核表達載體。
　　2、構(gòu)建M片段（編碼糖蛋白）分段真核表達載體。
　　3、表達核蛋白，研究重組核蛋白NP的生物學活性。
　　方法：
　　1、設計引物擴增NP、Gn和Gc。
　　2、設計引物分20段擴增M片段(M1-M20)，每段重疊30個堿基。
　　3、設計引物分別擴增NP、Gn和M1，建立與GFP的融合蛋白序列，監(jiān)測蛋白表達情況。
　　3、將目的基因與克隆載體19

4、T(Simple)連接擴增后，再與表達載體pVAX1連接。
　　4、將目的基因-pVAX1構(gòu)建的表達載體用陽性脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至Vero細胞，在Vero細胞內(nèi)表達，用Western blot、間接免疫熒光、顯微鏡觀察融合蛋白熒光的方法檢測蛋白表達，用鎳柱純化帶His標簽的NP。
　　5、包被純化的NP，包被板與商品化試劑盒同時檢測羊血清中SFTSV抗體，比較檢測的效果。
　　6、用純化的NP免疫BALB/c小鼠，測定血清滴

5、度。
　　結(jié)果：
　　1、構(gòu)建出核蛋白NP，糖蛋白Gn、Gc，M片段分段蛋白的真核表達載體，構(gòu)建出NP、Gn、Gc、M1分別和GFP的融合蛋白表達載體，測序正確。檢測到上述蛋白在Vero細胞中的表達。
　　2、用NP自行包被的包被板與商品化的試劑盒在檢測羊血清陽性率的效果上，沒有統(tǒng)計學差異。
　　3、用NP免疫BALB/c小鼠獲得有效陽性血清。
　　結(jié)論：
　　1、構(gòu)建的pVAX1真核表達載體，轉(zhuǎn)染V