風疹病毒包膜糖蛋白E1的真核表達及其生物學活性研究.pdf

1、風疹病毒(rubella vires，RV)是披膜病毒科風疹病毒屬的唯一成員，人類是RV的唯一自然宿主。人群對RV普遍易感，感染后可發(fā)生風疹。RV除了感染人外，實驗室還能感染恒河猴、絨猴、猩猩、狒狒、乳鼠、地鼠和兔等野生和實驗動物，并出現(xiàn)與人相似的感染過程，包括潛伏期、病毒血癥及免疫應答反應等，但不出疹，僅狒狒感染：RV后出現(xiàn)皮疹。 風疹(rubella)，也叫德國麻疹，通常是一種非常溫和的疾病，一般不引起嚴重后果，通常只引起皮

2、疹、頜下淋巴結腫大和其他輕微的體征。但在年長的兒童和成年人，尤其是婦女，風疹的后果可能要嚴重的多，包括關節(jié)疾病和紫癜。RV感染的危害主要在于先天性感染，即胎兒宮內感染。孕期前12周感染可導致胎兒先天風疹感染和80～90％的患風疹的孕婦流產(chǎn)。胎兒的先天性感染會導致先 天性風疹綜合征，累及多器官、多系統(tǒng)，并存在長期的活性感染。 臨床上，病毒存在于病人的鼻咽分泌物、血液、糞便和尿液中。雖然風疹經(jīng)常為隱性感染，但亞臨床表現(xiàn)的病人也

3、有傳染性，這對風疹的預防帶來了一定的難度。病毒通過氣溶膠擴散，在出現(xiàn)皮疹前的7天和出現(xiàn)皮疹后的7天從鼻咽排出，具有傳染性。 先天性風疹綜合征包括結構畸形(主要表現(xiàn)為神經(jīng)性耳聾，白內障，心臟疾病如肺動脈和心臟瓣膜狹窄、動脈導管未閉)和智力發(fā)育障礙，晚期并發(fā)癥包括糖尿病、甲狀腺疾病、生長激素缺乏和進行性腦炎。 1962年，風疹的病原體RV分離成功，為RV的分子生物學研究、血清學檢測、RV感染特別是先天性感染的診斷及疫苗研制等

4、奠定了基礎。 RV基因組為單股正鏈40S RNA，全長9 762個核苷酸，其5<'、〉端和3〈'、〉端含有兩個開放閱讀框架，分別編碼病毒非結構蛋白和結構蛋白。RV亞基因組：RNA，編碼一個分子量為110 kDa的病毒結構蛋白的前體p110，p110經(jīng)切割后產(chǎn)生核衣殼蛋白C、包膜糖蛋白E1和E2，其編碼順序為NH<,2>-C-E2-E1-COOH。 C蛋白富含脯氨酸和精氨酸，與病毒RNA結合構成核衣殼，在病毒從一個宿主細胞

5、感染另一個宿主細胞的過程中對病毒基因組起保護作用。包膜糖蛋白E1和E2以異二聚體的形式存在于病毒包膜表面，形成刺突，含有能刺激宿主產(chǎn)生相應的免疫應答的抗原表位。 E1糖蛋白具有血凝素活性，還能刺激機體產(chǎn)生中和抗體，是RV的主要抗原。應用單克隆抗體(Mab)研究發(fā)現(xiàn)，E1至少有6種不重復的抗原位點，主要位于E1的246～285位氨基酸。雖然E1的整個氨基酸序列在不同的毒株之間存在一定差異，但是在抗原決定簇集中的區(qū)域，其氨基酸順序卻

6、是一致的。因此E1是RV免疫原性、分子流行病學、遺傳與變異和疫苗研制研究的重要目的蛋白。 E1糖蛋白共有481個氨基酸，有三個N-聯(lián)糖化位點，分別位于天冬酰胺(N)76、177、和209，在E1中這三個糖基化位點都被糖基化，每個位點連接的糖鏈約為2 kD，糖基化對于保持E1的生物學活性非常重要，而且會影響E1轉運到高爾基體，對維持E1的正確折疊和構型有重要作用。 E2蛋白由282個氨基酸組成，分子量為42～47 kD，有

7、3～4個N．聯(lián)糖基化位點。E2 C-端保留了El蛋白的信號肽，富含半胱氨酸?殘基(14個)，通過鏈內和鏈間的二硫鍵與E1蛋白形成穩(wěn)定的E1-E2異二聚體，利用E2蛋白上的靶信號將異二聚體轉運至高爾基體，進一步組裝成病毒顆粒。E2蛋白的生物學作用尚未確定，E2可能含有特異性的表位并且至少含有一個中和表位，也能刺激機體產(chǎn)生中和抗體，但抗原性弱。在E1-E2復合物中，E2表位可能被E1遮蓋，而不易接近宿主免疫系統(tǒng)，因而在RV感染中誘導低水平的

8、免疫反應。另外，E2在自身免疫性疾病中有一定作用，其生物學重要性同樣不能忽視。 因為很多病毒感染產(chǎn)生的癥狀與風疹的癥狀很相似，所以臨床診斷風疹不可靠?？煽康脑\斷依賴于特定的實驗室檢查。RV感染的實驗室診斷方法主要包括病毒分離、病毒顆粒的電子顯微鏡觀察、血清學與免疫學技術、病毒基因的診斷等。 病毒分離是一種經(jīng)典的、非?？煽康脑\斷方法，但培養(yǎng)周期長，操作復雜，生物影響因素多，因此一般不用作常規(guī)診斷方法。 目前RV感染

9、的診斷主要以血清學診斷為主，目前常用的實驗包括酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)、血凝抑制實驗(HI)、放射免疫技術(RIA)、乳膠凝集試驗(LA)、被動血凝試驗(PHA)和免疫熒光試驗(IFA)等幾種方法。其中ELISA為目前的首選方法。我國生產(chǎn)的用于檢測RV抗體的ELISA試劑盒為細胞培養(yǎng)抗原，其不足之處在于抗原純化時難以完全排除其中的細胞蛋白成分，抗原成分不均一，性質不夠穩(wěn)定，靈敏度及特異度較差。而國外進口的試劑盒雖然質量較高，但價格

10、普遍昂貴，不適合基層實驗室的使用。因此，構建RV抗原的重組表達克隆，研究制備我國自己的重組RV抗原具有重要實際意義。 聚合酶鏈反應(PCR)技術出現(xiàn)以后，逐步發(fā)展了直接檢測RV核酸的診斷方法。用PCR檢測RV RNA，方便、快捷、靈敏度高、結果可靠，是很有前途的實驗診斷方法。但該檢測方法要求一定的設備和技術條件，不易在基層實驗室推廣使用，而且容易造成實驗室污染，產(chǎn)生假陽性。 自病毒分離成功后，各國致力于風疹疫苗的研究。1

11、966年Meyer首先研制成功HPV77株風疹減毒活疫苗，1969年獲準在美國使用。其它一些毒株的風疹減毒活疫苗也相繼問世。目前國外使用的風疹減毒活疫苗主要有以下幾種：HPV77-DE5或HPV77-DK12疫苗，Candehill疫苗，RA27/3疫苗，TO-336疫苗。HPV77-DE疫苗免疫效果肯定，但副反應發(fā)生率高；Candehill疫苗免疫效果好，副反應也相對較低，但由于成本高，、目前世界上很少使用；TO-336疫苗也有較高的

12、免疫原性，安全性較好，其產(chǎn)生的體液免疫應答類似于自然感染，并可能形成鞏固的免疫；RA27/3疫苗接種后可產(chǎn)生沉淀抗體和口咽部局部分泌性IgA(SIgA)，同時接種后的反應也較HPV77疫苗輕，因此是目前應用范圍最廣的風疹減毒活疫苗。該活疫苗于1979年在美國通過審批并投入使用，該疫苗抗體陽轉率在95％以上，接種后可能有短期發(fā)熱、皮疹、淋巴結腫大及關節(jié)腫痛等反應，免疫后抗體持久性一般可維持10年左右。 因為減毒活疫苗的RNA有感染

13、性，有回復突變的可能，而且疫苗可通過胎盤，導致胎兒感染，有潛在的致畸可能性。所以，其安全性仍存在著較大爭議。而且成年婦女接種后可發(fā)生一過性關節(jié)炎(10％)和關節(jié)痛(2.5％)，尤其是產(chǎn)后接種。因此有必要開發(fā)新型疫苗。RV基因工程疫苗則能消除減毒活疫苗的上述缺點，是當今RV研究的熱點之一。 本研究采用現(xiàn)代分子生物學的理論和技術，如基因重組、基因克隆、序列分析、基因的真核表達、SDS-PAGE、Westem—blot、ELISA等，

14、構建了RV包膜糖蛋白El的全長基因的酵母表達載體，并在畢赤酵母中表達出E1糖蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和Western—blot分析后，將重組蛋白包被ELISA檢測板，用于檢測90份人類血清，并與進口和國產(chǎn)試劑盒做了比較分析。將所得的重組抗原免疫BABL/c鼠，觀察其免疫原性。 一、風疹病毒包膜糖蛋白El酵母表達載體的構建 以質粒pMDl8T-El為模板，應用PCR方法擴增RV糖蛋白El的全長基因，并在基因兩端創(chuàng)建相應

15、的酶切位點。El基因與pBluscript ⅡSK<'+>載體均經(jīng)雙酶切后連接，轉化大腸桿菌JM109，經(jīng)氨芐青霉素和藍白斑篩選并測序，建立了克隆載體pBluscript Ⅱ SK<'+>-El，克隆載體與表達載體pGAPAaA雙酶切后連接，轉化大腸桿菌JM109，經(jīng)Zeocin篩選并測序。 結果顯示，PCR擴增后出現(xiàn)一條約1.5kb的條帶，體外重組技術重組于重組質粒pBluscriptⅡ SK<'+>和pGAPAaA后，經(jīng)P

16、CR、EcoR Ⅰ及Xba Ⅰ雙酶切均出現(xiàn)相應長度的片段，測序證實為包膜糖蛋白El的基因。本研究首先成功地構建了含有RV包膜糖蛋白El全基因的克隆載體及酵母表達載體，為El糖蛋白的表達和生物學特性的研究奠定了基礎。 二、風疹病毒JR23株糖蛋白El在畢赤酵母表達系統(tǒng)中的表達和抗原性分析 El基因的表達質粒pGAPZαA-E1經(jīng)AvrⅡ線性化后用LiCl法轉化酵母菌，在YPD(含100 μg/ml Zeocin)平板

17、上兩次篩選，挑出單菌落，于液體YPD中培養(yǎng)，并在不同時點收集培養(yǎng)物，用SDS-PAGE和Westem-blot進行分析。SDS-PAGE分析顯示El重組蛋白在畢赤酵母中高效穩(wěn)定表達，在48 h時表達量達到最高，之后趨于穩(wěn)定，上清和細胞中均有蛋白表達。Western-blot分析結果表明上清中的El重組蛋白能夠分別與抗RV的陽性血清和單克隆抗體(MAb)反應，而細胞中的El重組蛋白只能與抗RV的陽性血清反應，不能與MAb反應。這說明所表達

18、的蛋白一部分在信號肽的引導下分泌出細胞外，并經(jīng)過折疊形成了正確的構象，能夠與MAb結合；而另一部分由于蛋白本身的跨膜區(qū)連在了細胞膜上沒有分泌出去，沒有形成能夠被MAb識別的構象，不能與MAb結合。提示E1包膜糖蛋白在酵母菌中成功表達，且免疫反應性良好。 三、酵母系統(tǒng)表達的風疹病毒E1糖蛋白在ELISA診斷中的應用研究 將重組E1抗原和RV分別作為包被抗原，用間接ELISA法檢測90份臨床血清標本，同時用晶美(JINGMEI

19、)進口分裝試劑盒和德國RECI公司試劑盒進行檢測；將RECI試劑盒作為金標準，計算另外三者檢測結果的特異度、靈敏度和符合率；比較它們之間的差別有無統(tǒng)計學意義，特別是重組抗原與病毒抗原作為包被抗原檢出RV抗體陽性率的差別有無統(tǒng)計學意義。 與德國試劑盒相比，該重組抗原靈敏度為67.11％，特異度為71.43％，兩者的符合率為67.78％；病毒抗原分別為50％、78.57％、54.44％；晶美試劑盒分別為84.71％、71.43％、8

20、2.22％。重組蛋白重復性實驗結果經(jīng)統(tǒng)計學處理P>0.05，差別無統(tǒng)計學意義；RECI試劑盒與重組抗原、病毒抗原的檢測結果的差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；RECI試劑盒與晶美試劑盒的檢測結果的差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；晶美試劑盒與重組抗原的檢測結果的差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；重組抗原與病毒抗原的檢測結果的差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，作為包被抗原，重組抗原優(yōu)于病毒抗原。結果表明用畢赤酵母表達的RV E1重組蛋白作

21、為包被抗原進行ELISA檢測優(yōu)于病毒作為包被抗原，具有廣闊的應用前景。 四、重組E1蛋白的免疫原性研究 動物實驗設計遵循臨床實驗設計的三大原則：隨機化、重復、對照。將BABL/c小鼠隨機分組，每組8只。同時設立實驗組(重組抗原加佐劑免疫)、空白對照組(PBS加佐劑免疫)、陽性對照組1(減毒活疫苗免疫)、陽性對照組2(RV JR23株免疫)和陰性對照組(pGAPZaA空質粒的表達產(chǎn)物加佐劑免疫)。分別用重組抗原、P

22、BS、減毒活疫苗、RV JR23株和pGAPZaA空質粒的表達產(chǎn)物腹腔注射免疫動物。初次免疫時，分別用溶于100 μl PBS的45μg重組抗原、100 μl PBS、200μl減毒活疫苗、200μl 10<'5>TCID<,50>的RV JR23、溶于100μl PBS的pGAPZαA空質粒的表達產(chǎn)物免疫實驗動物的不同組。初次免疫后的第2、4、6周，均用初次免疫減半的抗原量再次免疫。 末次免疫后，鼠眶靜脈取血，凝固后取血清，E

23、LISA法檢測血清中的抗風疹IgG抗體。用卡方檢驗對檢測結果進行統(tǒng)計學檢驗，X<'2>=21.7885，P<0.05，可見各組之間檢測結果的差別有統(tǒng)計學意義。分別比較實驗組與其他4個組之間的檢測結果。實驗組與空白對照組檢測結果的差別有統(tǒng)計學意義，可以認為實驗組的陽性率高于空白對照組的陽性率。實驗組與陽性對照組1的檢測結果的差別無統(tǒng)計學意義。實驗組與陽性對照組2的檢測結果的差別無統(tǒng)計學意義。實驗組與陰性對照組的檢測結果的差別有統(tǒng)計學意義

24、，可以認為實驗組的陽性率高于陰性對照組的陽性率。此檢驗結果表明，在本研究中，重組抗原作為免疫原免疫BABL/c小鼠與減毒活疫苗作為免疫原免疫BABL/c小鼠、RV JR23株作為免疫原免疫BABL/c小鼠的免疫效果的差別沒有統(tǒng)計學意義，與PBS和空載體的表達產(chǎn)物的免疫效果的差別有統(tǒng)計學意義，證明重組抗原能使小鼠產(chǎn)生風疹的特異性抗體，是一種較好的免疫原。 將眶靜脈取血后的小鼠拉頸處死，無菌取脾，制成單個細胞懸液，進行脾的淋巴細胞增殖

25、實驗(MTT法)。對檢測結果進行隨機區(qū)組設計的方差分析，F(xiàn)=7.30，P<0.05，表明5組之間的差別有統(tǒng)計學意義。隨后選擇陰性對照組的結果為對照，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較的新復極差法進行統(tǒng)計分析，結果實驗組和陰性對照組間的淋巴細胞增殖反應的差別有統(tǒng)計學意義，可以認為實驗組的淋巴細胞反應性高于陰性對照組的淋巴細胞反應性，陽性對照組1和陽性對照組2的淋巴細胞反應性與陰性對照組間的淋巴細胞反應性的差別均無統(tǒng)計學意義。