漢坦病毒GM04-38株包膜糖蛋白上融合肽的初步確定.pdf

1、目的: 已有計算機程序的分析預測結果顯示漢坦病毒的G2糖蛋白可能是其融合蛋白，而且屬于Ⅱ類融合蛋白，而內在的結構區(qū)（aa763～785）很可能是介導膜融合的關鍵部位--融合肽。另外，已有實驗證據(jù)支持漢坦病毒的融合肽位于糖蛋白G2而不是G1上。鑒于漢坦病毒GM04-38株也存在上述保守區(qū)（aa763～785），本研究擬通過實驗對此保守區(qū)是否為其融合肽做出初步判斷。從而為闡明HV的細胞融合機制、研制有效的漢坦病毒新型疫苗和治療制劑奠定基礎。

2、 方法: 根據(jù)GM04-38株M片段cDNA基因序列應用Primer 5軟件設計引物，同源重組PCR法構建10個單個氨基酸突變的糖蛋白G2的克隆載體。PCR擴增糖蛋白突變體的G2編碼區(qū)基因，雙酶切后與經過同樣雙酶切的表達載體pCAGGS/MCS連接，轉化大腸桿菌DH5a，氨芐青霉素篩選糖蛋白G2單個氨基酸突變體的表達載體。經雙酶切和測序證實。然后將野毒株G1Bg1與GmG2/某糖蛋白G2突變體表達載體共轉染Vero E6細胞，間

3、接免疫熒光檢測蛋白表達情況，并經酸性MEM處理、Giemsa染色后觀察細胞融合現(xiàn)象的發(fā)生。 結果: 1．構建了10個糖蛋白G2單個氨基酸突變的克隆載體C765A、P767D、P768D、C770A、P771D、G772D、G774D、G776D、C777A、C780A，雙酶切鑒定目的片段和載體分別為1．6kb和2．7kb，并經測序證實。 2．構建了10個糖蛋白G2單個氨基酸突變的表達載體GmG2-C765A、Gm

4、G2-P767D、GmG2-P768D、GmG2-C770A、GmG2-P771D、GmG2-G772D、GmG2-G774D、GmG2-G776D、GmG2-C777A、GmG2-C780A，雙酶切鑒定目的片段和載體分別為1．6kb和4．7kb，并經測序證實。 3．間接免疫熒光實驗顯示野毒株G1Bg1與GmG2共轉染組、G1Bg1與某糖蛋白G2突變體表達載體共轉染組均有亮綠色熒光信號產生，呈胞漿分布。 4．野毒株G1B