重組HIV-1包膜糖蛋白gp120和gp41的表達(dá)、純化及初步應(yīng)用.pdf

1、本研究利用分子生物學(xué)手段，將gp120和gp41的編碼基因分別重組到畢赤酵母及大腸桿菌的表達(dá)載體中，并成功地進(jìn)行了蛋白表達(dá)。 外膜糖蛋白gp120的編碼基因的克隆和在畢赤酵母中的表達(dá)。以質(zhì)粒pHXB2-gp160為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出gp120抗原的全長(zhǎng)DNA(gp120L)和短片段DNA(gp120S)，構(gòu)建了酵母表達(dá)載體pPICZαA-gp120L和pPICZαA-gp120S。將重組質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115細(xì)

2、胞株，使gp120基因同源重組整合到畢赤酵母的染色體上，經(jīng)過選擇培養(yǎng)基、PCR鑒定、Zeocin抗性篩選后，將得到的陽性菌株進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，利用SDS-PAGE和Westernblot分析表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果表明gp120L基因沒有得到表達(dá)，gp120S基因在酵母胞內(nèi)有微量表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物為19kD?？缒ぬ堑鞍譯p41短片段基因在大腸桿菌中的表達(dá)、純化及初步應(yīng)用。同樣以pHXB2-gp160為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出gp41抗原短片段DNA，構(gòu)

3、建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-gp41S,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plys，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過SDS-PAGE和Westernblot分析證實(shí)35.5kD的目的蛋白gp41S主要存在于包涵體中，凝膠掃描成像分析證實(shí)其表達(dá)量占菌體總蛋白的10％以上。包涵體經(jīng)過洗滌、溶解和復(fù)性后，純度可達(dá)90％以上，表明已獲得高純度的目的蛋白。用純化的重組gp1蛋白作為包被抗原，應(yīng)用間接ELISA法對(duì)4份HIV陽性血清中的gp41抗體進(jìn)行